广东药学院学报 第25卷 第3期 危智盛，等.甲泼尼龙对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠SRp30c的影响1 材料与方法
1.1 实验材料
Wistar雌性大鼠，体质量180～200 g;豚鼠，体质量350～400 g，均购自南方医科大学实验动物中心(许可证号：Scxk粤2006?0015);不完全弗氏佐剂购自Sigma公司;卡介苗冻干粉、百日咳菌液购自中国药品生物制品检定所;总RNA提取试剂Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Toyobo公司);甲泼尼龙(Pfizer Manufacturing Belgium NV公司)。
1.2 EAE模型制备[3]
以豚鼠全脊髓制成无黏性50%(V∶V)髓鞘碱性蛋白(MBP)生理盐水匀浆。将卡介苗冻干粉与不完全弗氏佐剂混匀，配成卡介苗浓度为4 mg/mL的完全弗氏佐剂。再将MBP匀浆与等体积的完全福氏佐剂混合，反复抽打成油包水样，制成抗原乳剂。戊巴比妥钠腹腔麻醉Wistar大鼠后在大鼠四肢足垫分别注入抗原乳剂共0.4 mL，并在大鼠左后肢足背皮下注射0.1 mL百日咳菌液(约含3×109个菌体)。免疫接种后每天观察大鼠反应、进食、体质量、行动等情况。依据Kono[4]标准对神经损害症状进行评估：正常或无任何神经缺损症状，记0分;I级：尾部肌张力消失，可见轻度步态笨拙，记1分;Ⅱ级：尾部无力，双后肢肌张力低，记2分;Ⅲ级：尾部无力，双后肢瘫痪，但给予刺激后可挪动，记3分;IV级：瘫痪累及前肢，伴尿便失禁，记4分;V级：濒死状态或死亡，记5分。症状介于两标准级之间以±0.5分记。
1.3 实验分组及给药
EAE发病大鼠随机分成3组，分别为：①大剂量组8只，予MP 100 mg/kg;②小剂量组8只，予MP 25 mg/kg;③模型对照组7只，予等容量生理盐水;另取5只未经造模的Wistar大鼠同等条件下饲养作为正常对照组，予等容量生理盐水。造模后第12天，大鼠发病达高峰时开始给药。MP以生理盐水稀释后自尾静脉缓慢注入，每日给药1次，连续3 d后均减半量再给药2 d，共给药5次。
1.4 组织取材
各组给药5 d后，于第6天进行评分后处死，取大鼠部分新鲜脊髓组织置液氮保存，备作总RNA提取。另取大脑视交叉层面2 mm脑组织、小脑、脑干、脊髓颈膨大、腰膨大部分4%多聚甲醛固定做常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察脑、脊髓组织的形态学变化。
1.5 RT?PCR
新鲜脊髓组织研磨制成Trizol匀浆，异硫氰酸胍?苯酚?氯仿一步法提取总RNA,紫外分光光度法测定RNA的量和纯度。cDNA合成及PCR扩增反应体系均按试剂盒说明进行。引物由Invitrogen公司合成，SRp30c引物序列：sense:5′?TTCTAA ACACAGTGGGCGACTC?3′,antisense:5′?TACGTAATT TCGACCAGAGCCA?3′, 产物199 bp; 内参 G3PDH序列：sense:5′?ACCACAGTCCATGCCATCAC?3′,antisense:5′?TCCACCACCCTGTTGCTGTA?3′，产物450 bp。PCR产物与loading buffer混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪观察后成像，Qantity one凝胶图像分析系统测定SRp30c及G3PDH的吸光度，计算SRp30c/G3PDH值，作为SRp30c mRNA的表达水平。
1.6 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行分析，首先对数据做正态性检验，计量资料以±s表示。若符合正态分布，两组间用t检验;多组间参数比较采用单因素方差分析;多组均数两两比较采用LSD?t检验分析;相关关系采用Pearson相关分析。
2 结 果
2.1 EAE大鼠发病情况
免疫诱导后，大鼠于第10天始先后发病，表现为体质量进行性下降、尾巴张力减退，继之尾巴无力，并发展为后肢及四肢无力、麻痹、大小便失禁。Kono评分1分以上即为发病。EAE大鼠脑、脊髓组织HE染色光镜下可见小血管充血、管壁增厚、内皮细胞有破坏、血管周围大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，并在小血管周围形成典型的“袖套样(cuffing)”改变。而正常对照组大鼠脑和脊髓均未见异常。