胎鼠肺发育中PI3K-AKT信号传导通路效应物表达

【摘要】  目的 探讨1-磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号传导通路效应物在胎鼠肺发育过程中的表达。方法 运用Western蛋白印迹方法检测不同胎儿期鼠肺上皮细胞中AKT、磷酸化AKT (pAKT)及相关蛋白的表达。运用免疫组织化学方法检测不同胎儿期鼠肺上皮细胞中pAKT的表达水平。结果Western蛋白印迹法显示，AKT在不同胎儿期肺上皮细胞中的蛋白表达无明显差异；第12天胎鼠肺pAKT高度表达，第14天开始减少；第12天胎鼠肺cyclinD1高度表达，第14天开始减少；第12天胎鼠肺SPC低度表达，第14天开始逐渐增加。免疫组织化学法显示，第14天胎鼠肺上皮细胞中pAKT高度表达，第18天胎鼠肺上皮细胞中pAKT无明显表达。结论 PI3K-AKT信号传导通路通过许多生物过程在胎鼠肺发育中起重要作用。 
【关键词】  丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B 肺发育 小鼠 近交ICR
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of PI3K-AKT signal pathway in fetal mouse lung development. MethodsThe expression of AKT, phosphorylated AKT (pAKT) and the downstream proteins were examined with Western blotting and immunohistochemistry in the epithelium of fetal mouse lung at different time points.ResultsWestern blotting showed that the expression of AKT was not significantly changed in embryonic lungs during development, while phosphorylated AKT (pAKT) was highly expressed on embryonic day 12 (E12) and started decreasing from embryonic day 14 (E14). CyclinD1 was highly expressed on E12 and started decreasing from E14. SPC was lowly expressed on E12 and started increasing from E14. Immunohistochemical study showed that pAKT was expressed in the respiratory epithelium on E14. However, pAKT was not obvious expressed on E18. ConclusionThe PI3K-AKT signal pathway plays a pivotal role in mouse lung development through various biological processes.
    ［KEY WORDS］Serine/threonine protein kinase B; Lung development; Mice, inbred ICR
    丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B（又被称作AKT）参与多种细胞功能，例如细胞再生、分化和存活等［1］。1-磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）可以调节AKT活性。AKT被活化后，与细胞膜分离后进入细胞核，并且在细胞核中被磷酸化后可以调节许多生物过程。据文献报道，成纤维细胞生长因子(FGFs)可以通过激活PI3K-AKT信号传导通路在许多分支器官的发育中起重要作用，例如它能促进肾脏、乳腺、前列腺等器官的发育［2］。然而，PI3K-AKT信号传导通路和肺发育的关系至今仍未清楚。据文献报道，PI3K-AKT的下流效应物，如Rac1和Cdc42能刺激cyclinD1的表达［3］。cyclinD1是哺乳动物细胞循环链的关键调节器, 它可以增强呼吸道上皮细胞的增生。在肺的发育过程中，决定细胞类型分化的转录因子中表面活性脱辅基蛋白C(SPC)转录因子可以加强呼吸道上皮细胞的分化［4］。然而，cyclinD1 和SPC是如何通过PI3K-AKT信号传导通路来调节肺发育的仍不清楚。因此，本实验探讨PI3K-AKT信号传导通路效应物在肺发育中所起的作用。现将结果报告如下。
    1  材料与方法
    1.1  动物
    ICR大鼠由日本SLC公司提供。为了得到胚胎鼠的肺，让大鼠在夜间交配，次日作为胚胎第0天（E0），胚胎鼠第12、14、16、18天（E12、E14、E16、E18）的肺被用于本实验中作蛋白印迹检测。E14和E18的胚胎鼠肺用于免疫组织化学染色。
    1.2  Western印迹检测
    大鼠在受孕E12、E14、E16、E18时分别被处死，解剖留取胚胎鼠的肺组织，按每50 mg肺组织加500 μL细胞裂解液（包括NP-40、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、苯甲磺酰氟）将肺组织制成匀浆。用牛血清清蛋白绘制标准蛋白曲线，检测样品蛋白浓度。取含总蛋白25 μg的组织裂解产物，于120 g/L的SDS-PAGE上电泳（BioRad公司，美国），转PVDF膜，封闭后以1∶1 000兔抗鼠单克隆抗体AKT(Santa Cruz公司，美国),pAKT(Santa Cruz公司，美国), cyclinD1 (Santa Cruz公司，美国),SPC(Santa Cruz公司，美国)，β-actin(Sigma 公司,日本)室温孵育2 h。加入1∶5 000羊抗兔IgG辣根过氧化物酶抗体(Santa Cruz公司，美国) 室温孵育1 h。抗原抗体反应后，用ECL蛋白印迹检测系统（Amersham公司，美国）进行检测，再经X线片曝光。曝光胶片用Image Scanner(Amersham公司)扫描，ImageQuant TLV 2003软件分析各条带灰度值，结果以AKT与β-actin蛋白条带灰度值的相对比值表示。AKT、pAKT、cyclinD1、SPC、β-actin组按相同实验条件重复3次，进行统计分析。