胎鼠肺发育中PI3K-AKT信号传导通路效应物表达(2)

    1.3  免疫组织化学检测
    在室温下，E14和E18的胚胎鼠肺放入40 g/L的多聚甲醛磷酸缓冲溶液（pH 7.3）中固定3 h，将固定组织在磷酸缓冲液中冲洗后，用OCT混合物包埋后用液氮冷冻。取每组中的每一个OCT混合物包埋肺组织块，连续切成5 μm厚的组织片置于玻片上，经蒸馏水冲洗后，按常规ABC免疫组织化学法染色。pAKT（Cell Signaling公司，美国）滴度均为1∶400，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染。胞核中见棕黄色颗粒为阳性。
    1.4  统计学处理
    计量资料以x±s表示，用SPSS 13.0软件进行统计分析。
    2  结    果
    2.1  Western印迹检测
    AKT在胎儿肺组织发育过程中表达强而且无改变，各时间点比较差异均无显著意义（P>0.05）。pAKT在E12肺组织中表达最强，然后随着胎龄的增加，其表达逐渐减弱（F=58.886,q=2.384~17.289,P<0.05）。cyclinD1从E12至 E18表达逐渐减弱（F=18.693,q=2.544~10.194,P<0.05）。而SPC从E12至E18表达逐渐增强（F=130.290,q=7.673~26.444,P<0.05）。见图1、表1。

    2.2  免疫组化检测
    pAKT在E14肺组织的呼吸道上皮细胞中表达最强，而在E18肺组织的呼吸道上皮细胞中无明显表达。
    图1  AKT/pAKT、cyclinD1和SPC在鼠E12、 E14、E16、E18肺组织蛋白质的表达表1  AKT、pAKT、cyclinD1、SPC在鼠肺组织中表达含量变化
    3  讨    论
    本实验研究了鼠胎儿肺发育过程中AKT以及其磷酸化形式的蛋白质表达，并且与细胞增生及分化调节因子即细胞增生活化因子cyclinD1和细胞分化标志物SPC进行了比较。本实验结果显示，磷酸化AKT在胎儿肺发育的早期表达较强，而到出生前表达逐渐减弱。这种逐渐减弱的蛋白质表达方式与胎儿肺组织细胞增生活力的改变是一致的。因为在本实验中细胞增生活化因子cyclinD1在胎儿肺发育早期表达强，说明其细胞增生活力高，而随着胎龄的增加，其表达逐渐减弱。另外，本实验通过免疫组织化学法检测出在胎儿肺发育的早期，磷酸化AKT大量存在于肺呼吸道上皮细胞中，而在肺发育的晚期呼吸道上皮细胞中无明显表达，从而推测出磷酸化AKT与早期肺发育有关，并且磷酸化AKT通过激活细胞循环链的调节器cyclinD1而使细胞增生活力增强，促进呼吸道的构建。
    据报道，在鼠肺发育的E12～E14，SPC可以在原始未分化的肺上皮细胞中表达，而在鼠肺发育的E17.4至生后第5天,肺泡Ⅰ型及Ⅱ型上皮细胞开始分化,此时SPC仅在Ⅱ型上皮细胞中表达［5］。这与随着肺发育，肺的细胞分化及增生增强，肺功能逐渐完善的理论相一致［6］。但是，我们不能从简单的SPC表达上说明肺泡细胞是如何分化的。肺泡细胞分化标志物SPC随着胎龄的增加表达增强，而磷酸化AKT表达减弱，考虑在PI3K-AKT信号传导通路下游存在一个负反馈信号。据报道，AKT可以通过抑制GSK-3活力来调节许多生物过程［7］。此理论支持本实验结果。
    根据本实验结果，我们不能简单地阐明PI3K-AKT信号传导通路在肺组织发育过程中的重要意义，然而可以提示磷酸化AKT在肺组织发育中可以调节细胞增生调节因子cyclinD1和分化调节因子SPC的活力，从而推测出这些因子变化可能与胎儿肺组织发育中的生物现象有关。总之，我们认为PI3K-AKT信号传导通路作用在胎儿肺发育中的许多重要生物过程中，如果我们能明确细胞增生及分化的机制，对肺发育异常、肺组织重塑和肺癌的治疗及预防将有重要意义。
【参考文献】
  ［1］ RAMEH L E, CANTLEY L C. The role of phosphoinositide 3-kinase lipid products in cell function［J］. J Biol Chem, 1999,274:8347-8350.