卵巢癌组织中uPA与PAI1 mRNA表达及意义(2)

    1. 2  方法
    1.2.1  总RNA抽提  每份冷冻标本取100 mg，剪碎,加入Trizol溶液1 mL裂解，按 Trizol 一步法抽提得到总RNA，紫外线分光光度计检测RNA浓度和纯度,放置-70 ℃冰箱保存。
    1.2.2  RT?PCR反应  取0.18 μg总RNA,在50 μL体系中扩增，引物由上海生工生物工程公司合成［2］。uPA引物序列 Primer 1: 5′?ACTACTACGGCTCTGAAGTCACCA?3′，Primer 2:5′?GAAGTGTGAGACTCTCGTGTAGAC?3′。RT?PCR产物长度为200 bp。uPA RT?PCR条件为：50 ℃反转录30 min，95 ℃预变性15 min；然后94 ℃变性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min,30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PAI?1引物序列 Primer 1:5′?TG?CTGGTGAATGCCCTCTACT?3′ ，Primer 2:5′?CGGTCATTCCCAGGTTCTCTA?3′。RT?PCR产物长度398 bp。PAI?1 RT?PCR条件为：50 ℃反转录30 min，95 ℃预变性15 min；然后94   ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min,32个循环；最后72 ℃延伸10 min。内对照看家基因GAPDH引物序列 Primer 1：5′?ACTGCCACCCAGA?AGACT?3′,Primer 2:5′? GCTCAGTGTAGCCCAGGAT?3′。RT?PCR产物长度292 bp。GAPDH RT?PCR条件为：50 ℃反转录30 min，95 ℃预变性15 min；然后94 ℃变性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min,27个循环；最后72 ℃延伸10 min。
    1.2.3  RT?PCR半定量分析  取3 μL PCR扩增产物，经20 g/L琼脂糖电泳后，置于凝胶成像分析仪下经Biocaptmw软件分析。分别将uPA、PAI?1 mRNA与GAPDH PCR产物电泳条带扫描灰度值相比，其比值作为uPA及PAI?1基因表达的数值并进行半定量分析。
    1. 3  统计学处理
    采用SPSS 11.0软件包进行统计分析,实验结果以±s表示，组间比较采用F检验。
　　2  结    果
    2.1  不同组织中uPA和PAI?1 mRNA的表达
    uPA mRNA在卵巢癌组织中的表达显著高于卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织(F=184.51,q=22.63～26. 69，P<0.05);uPA mRNA在卵巢良性上皮性肿瘤和正常卵巢组织中的表达无统计学差异（q=0.54，P>0.05）。PAI?1 mRNA在卵巢癌组织中的表达显著高于卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织(F=51.00,q=11.34～11.95, P<0.05)；PAI?1 mRNA在卵巢良性上皮性肿瘤和正常卵巢组织中的表达无统计学差异（q=0.19，P>0.05）。见表1。
    2.2  卵巢癌不同分化程度的组织中uPA和PAI?1 mRNA的表达
    在低、中、高3种不同分化程度的卵巢癌组织中uPA 及PAI?1 mRNA的表达随分化程度降低而增加,差异有显著意义(F=110.62、38.43,q=3.10～6.86，P<0.05)；其中以低分化卵巢癌组织中uPA 及PAI?1 mRNA的表达最高,分化越好的卵巢癌组织中uPA及PAI?1 mRNA表达越低。见表2。表1  uPA及PAI?1 mRNA在3种不同卵巢组织中的表达表2  uPA及PAI?1 mRNA在不同分化程度的卵巢癌组织中的表达