第五章 细胞培养实验
实验一 普通光学显微镜的结构和使用
【实验目的】
1.熟悉显微镜的结构和各部件性2.掌握低倍镜、高倍镜的正确使用油镜的使用方法。 【实验内容】
1.显微镜成像原理（图1—1） 标本（F1）置于聚光器与物镜之间，镜、聚光器各自相当于一个凸透光线自反射镜折射入聚光器，经聚增强，照射在标本上。标本的像经成像于F2处，像是倒像。目镜将此
步放大，并成像于人眼的视网膜上(F3)（正像）。 2.显微镜的结构
图1-1显微镜成像原理
能。 方法，熟悉
目镜、物镜。平行的光器集聚物镜放大例像进一
图1-2 光学显微镜结构示意图
1.目镜 2.镜筒 3.物镜转换器 4.物镜 5.透光孔 6.聚光器 7.光圈 8.反光镜 9.粗调节器10.细调节器 11.镜臂 12.移片器 13.载物台 14.倾斜关节 15.镜柱 16.镜座 17.照明
1）机械部分
（1）镜座：显微镜的基座。起稳定和支持整个镜身的作用。有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造（图1—2）。
（2）镜臂：支持镜筒和镜台。镜筒直立式光镜在镜臂和镜柱之间有一可活
动的关节叫倾斜关节，可使镜臂作适当倾斜，便于观察。镜筒倾斜式显微镜由于镜臂和镜柱连为一体，故无此关节。
（3）镜筒：位于镜臂前方的圆筒，上端安装目镜，下端装有旋转盘。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式两类。
（4）载物台：在镜筒下方，方形或圆形．放玻片标本用。载物台中央有一圆形通光孔，两旁备有一压片夹。有的载物台上装有标本移动器，移动器上装有弹簧夹，用于固定标本片。移动器的一侧有两个旋钮，转动旋钮可使玻片前后左右移动。
（5）物镜转换器：圆盘状，在镜筒下方，其上装有3—4个放大倍数不同的物镜。旋转物镜转换器可更换物镜。 （6）聚焦调节器；为调节焦距之用。
大旋钮为粗调节器，转动粗调节钮可使镜筒(或载物台)升降，调节焦距。旋转一周可使镜筒(或戴物台)升降10mm。一般用于低倍镜调焦。
小旋钮为细调节器，转动细调节钮可使镜筒(或超物台)缓慢升降，每旋转一周约使镜筒(或载物台)升降0.1mm。适用于高倍镜、油镜或分辨物象清晰度调焦。 2）照明部分
（1）反光镜；载物台下方，一面为平面．一面为凹面。平面镜聚光力弱．适于强光源和平行光源。凹面镜聚光力强．适用于弱光源或散射光源。反射镜的方位可以随意调节。
（2）聚光器：在载物台下方，由一组透镜组成，可使反射光线聚集于标本上。一般在镜柱一侧有一旋钮，可使聚光器升降，和物镜配合使用。 （3）光圈：在集光器下方，由一组活动金属片组成，构成一个可开可缩的孔。在其外侧有一小柄，可以调节控制光线通过。在光圈的下方常装有滤光片架，可以放置不同颜色的滤光片。 3）光学部分
（1）目镜：短圆筒状，装在镜筒上端，其上刻有放大倍数，每台显微镜常备有3—4只放大倍数不同的目镜，如5×、10×、15×等。眼睛通过目镜观察物像。
（2）物镜：装在物镜转换器上的一组镜头，一般有低倍镜、高倍镜、油镜三种。每个物镜上刻有相应的标记。低倍镜筒上刻有10×或15×等标志，高倍镜筒上刻有40×或45×标志。油镜上一般为100×。N.A.表示镜口率，镜口率反映镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨力越高。各种物镜的比较见表1-1
注：分辨力用分辨率表示，指能把两个物点分开的最小距离。距离越近，其分辨率越高。显微镜的分辨力可用下列公式来计算： R＝0.61λ／N.A. （N.A.＝n?sinα/2）
上式中R为分辨力，N．A．为镜口率，n为介质的折射率，sinα/2为透镜视锥半顶角的正弦，λ为光波波长。 放大倍数的计算：
实物放大倍效=物镜放大倍数×目镜放大倍数
3.显微镜的使用方法 1）低倍镜的使用
检查：右手握镜臂，从镜箱内取出显微镜，左手托境座，轻轻放在实验桌上。先检查一下显微镜部件有无损坏，如发现有损坏或性能不良者，立即报告教师请求处理。
(1) 准备；转动粗调节钮，将镜筒略升高(或将载物台下降)使物镜与载物台距离略拉开。再旋转物镜转换器，将低倍镜对准裁物台中央的通光孔。
(2) 对光：打开光圈，上升聚光器，双眼同时睁开，向目镜内观察，同时调节反光镜的方向，直到视野内光线明亮均匀为止。反光镜的平面镜易把其他景物映入视野，一般用凹面镜对光。
(3) 放标本片：标本片的盖片朝上。将标本片放到裁物台前方，然后推到物境下面，用压片夹压住，如有标本移动器，可用上面的弹簧夹夹住标本片，然后把要观察的部分移到通光孔的正中央。
(4) 调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时旋转粗调节钮，使镜筒缓慢下降(或镜台上升)，大约低倍镜头与盖片间的距离约5mm时，再从目镜里观察视野，左手缓缓转动粗调节钮，使镜筒缓缓上升，直至视野中出现物像为止。如物像不太清晰，可转动细调节钮，使物像更加清晰。
如果按上述操作步骤仍看不到物像时，可能由以下原因造成： ① 转动调节钮太快，超过焦点。应按上述步骤重新调节焦距。 ② 物镜没有对正，应对正后再观察。
③ 标本没有放到视野内，应移动标本片寻找观察对象。
④ 光线太强，尤其观察比较透明的标本片或没有染色的标本时，应将光线调暗一些后，再现察。
2）高倍镜的使用
(1) 依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。 (2) 将需要观察的部分移到视野的中央。
(3) 眼睛从例面注视物镜，用手移动转换器．换高倍镜。
(4) 眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动纫调节钮，直至视野内看到清晰的物像为止。
如按上述操作仍看不到物像时，可能由下列原因造成：
① 观察的部分不在视野内，应在低倍镜下寻找到后再换高倍镜观察。 ② 标本片放反了，应将标本片放正后，再按上述步骤操作。 ③ 焦距没调好，应仔细调节焦距。
有的显微镜高倍镜与低倍镜不配套．从低倍镜转换高倍镜时，往往转不过来或损坏标本，如遇到这种情况，可把镜筒略升高(或载物台下降)，直接用高倍镜调焦。
方法是：从侧面注视物镜，调节粗调节钮，使高倍镜头下降至与标本片最短距离，再观察目镜视野，缓慢调节细调节钮，使镜头缓缓上升，直至物像清晰为止。
如需要更换标本片时，应该先把镜筒升高(或载物台下降)，然后把标本片移到载物台前方，再取下。
3）油镜的使用
(1) 先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，把要放大观察的部分移到视野中央。
(2) 把高倍镜移开，在标本片上滴一滴香柏油，眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换油镜，使镜面浸在油滴中。在一般情况下，转过油镜即可看到物像，如不清楚，可来回调动细调节钮，即可看清物像。如仍看不清，应按上述步骤重新操作。
(3) 找到物像后，再调节聚光器和光圈选择最适光线。
(4) 油镜使用完毕后，上升镜头约10mm，把镜头转到一边，用擦镜纸把镜头擦净。如仍擦不干净，可用擦镜纸蘸少许二甲苯轻擦，然后再用干净的擦镜纸擦一遍。
(5) 有盖片的标本片，可用擦镜纸蘸少许二甲苯，把油擦净。 4）使用练习
低倍镜使用练习：取一张A字片，用低倍镜观察。练习对光、调焦，并注意观察物像与玻片移动方向是否一致，镜下观察的字母是正像还是反像？
高倍镜使用练习；取一张羊毛交叉片(染成红色)．先用低倍镜观察，找到羊毛交叉点，移到视野中央，换高倍镜观察。调节焦距，注意观察上下羊毛的清晰度。
油镜使用练习：取一张人血涂片，先用低倍镜、高倍镜观察，再练习用油镜观察。注意比较三种物镜的放大倍数和分辨率有何不同。练习分辨红细胞、白细胞和淋巴细胞。练习擦洗油镜头和标本片。
4.使用显微镜的注意事项
(1) 取显微镜时必须右手握住镜臂，左手托镜座，切勿一手斜提，前后晃动，以防镜头或其他零件跌落。
(2) 观察标本时，显微镜离实验台边缘应保持一定距离，以免显微镜翻倒落地。
(3) 使用时要严格按步骤操作，熟悉显微镜各部件性能，掌握粗、细调节钮的转动方向与镜筒升降关系。转动粗调节钮向下时，眼睛必须注视物镜头。
(4) 粗、细调节钮要配合使用，细调节钮不能单方向过度旋转，调节焦距时，要从侧面注视镜筒下降，以免压坏标本和镜头。
(5) 用单筒显微镜观察标本，应双眼同时降开，左眼观察物像，右限用以绘图，左手调节焦距，右手移动标本或绘图。
(6) 禁止随意拧开或调换目镜、物镜和聚光器等零件。
(7) 显微镜的光学部件不可用手指、纱布、手帕或其他租糙东西擦拭，以免磨损镜面。需要时只能用擦镜纸擦拭。
(8) 凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品，如碘、乙醇溶液、酸类、碱类等都不可与显微镜接触．如不慎污染时，应立即擦干净。
【思考题】
1． 为什么使用高倍镜或油镜时，必须从低倍镜开始？
2． 显微镜下看到的物像是正像还是反像?物像与玻片的移动方向有何关系？
【作业】
1． 填图注明光学显微镜各部件的结构名称。 2． 怎样区分低倍镜、高倍镜和油镜?
3． 简述使用低倍镜、高倍镜和油镜的主要步骤。