2.消化与分散组织块：把组织块移入无菌青霉素瓶中，用眼科剪将组织块剪成1mm大小的小块．再用Hanks液洗涤2—3次，至液体澄清方可。弃去Hanks液，加入5—10倍体积的0.25％胰蛋白酶溶液(pH7．4—7．8)，盖好橡皮塞，置37℃水浴中消化20—30min，消化时每隔5min摇动一次，使组织块散开。视组织块变得疏松。颜色略变白时，从水浴中取出，在超净工作台中用吸管轻轻吸去消化液，加入2—3m1培养液(血清中含有胰蛋白酶抑制剂)，以终止消化。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态，静置片刻，让未被消化完的组织自然下沉，然后将上层细胞悬液移入无菌离心管中备用。
3.离心和计数：离心管平衡后以800—1000r／min离心5—10min，弃去上清液，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打混匀后取样计数。根据计数结果用培养液调整细胞浓度为5×10／m1细胞恳液。
4.接种培养：每25ml培养瓶接种1m1细胞悬液，再添加3ml培养液，轻轻混匀后盖瓶盖，标上细胞名称、组号和接种日期等，置37℃恒温培养箱中培养。也可以接种在24孔培养板或螺旋口培养瓶内，置CO2培养箱中开放培养(单层细胞培养接种浓度一般为1×l0—1×10／ml细胞悬液，可根据不同类型细胞和实验要求来确定接种浓度)。
5.观察：接种后每天要对培养的细胞做常规观察，注意有无污染、pH变化(培养液颜色变化)、细胞贴壁和生长情况等。如有污染，培养液迅速变黄pH降低，液体出现浑浊，或出现菌落等。
正常情况下，接种24h后，可见到许多细胞贴壁(由圆形悬浮状态延展成多角状)。培养3—4d时，细胞生长增殖旺盛，数量增加，并可见细胞形成独立小片(细胞岛)。细胞结构清晰，颗粒少，界限清楚。由于细胞生长旺盛，代谢产物不断堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体仍澄清，此时可换液一次。约7—10d细胞已基本铺满培养瓶形成致密单层，这时可进行传代培养。
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实验5.2 组织快培养法
【实验原理】
组织块培养是常用的、简便易行相对成功率较高的原代培养方法。把组织切割成0.5—1mm的小块后，由于组织块体积很小，能直接贴附于瓶壁上。然后细胞自组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片形成单层细胞。此方法程序比较简单，是当前各培养室常用的方法。
【实验方法】
1.取材：从动物体内取材方法与单层细胞培养取材相同。将取出的组织(肝、肾或肺)移入无菌的培养皿中，用Hanks液冲洗，去除血污。然后移入无菌青霉素小瓶或表面皿中，用眼科剪将组织反复剪成0.5—1mm的小块，再用吸管加2—3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中。
2.接种：用吸管分次吸取组织块悬液(吸取时注意让组织块吸在吸管端部，以免吸得过高，匙附管壁而丢失)，将其均匀排在培养瓶底壁上，翻转培养瓶，加入2—3ml培养液，盖好瓶盖，做好标记置于37℃恒温培养箱中2—3h后，待组织块能牢固贴于瓶壁上，再缓馒地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。
3.观察：组织块静止培养2—3d后，每天小心取出培养瓶置于倒置相差显傲镜下进行观察(注意尽量少晃动培养液，以防组织块脱落)。注意有无污染，已贴壁的组织块边缘有无细胞“长”出。一般先“长”出的是形态不规则的游走细胞，接着“长”出成纤维细胞或上皮细胞。
可根据培养液颜色变化，补加和更换培养液，同时注意吸除悬浮的组织块。细胞生长良好时，约10~15d可长成致密单层，这时可进行传代培养。
【作业】
1. 书写实验报告，记录实验过程和细胞生长情况。 【思考题】
1．简述细胞原代单展培养和组织块培养法的主要步骤。 2．在细胞培养中如何防上污染？
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实验六：细胞传代培养
【实验目的】
1.了解细胞传代的一般方法和步骤。 2.进一步熟悉培养过程中的无菌操作技术 【实验原理】
当培养细胞增殖达一定密度后，细胞的生长和分裂速度逐渐减慢、停止(出现接触抑制和密度抑制现象)，如不及时进行传代，细胞将逐渐衰老死亡。将培养的细胞从一个容器以1：2或其他比率转移到别的容器中扩大培养，称为传代培养。
大多数细胞在体外培养时能贴附在支持物表面生长，称贴附型生长细胞。少数种类的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长(如某些癌细胞和血液白细胞)，称悬浮型生长细胞。在体外这两种不同生长类型的细胞传代方式不同：贴附型生长细胞用酶消化法传代，而悬浮型生长细胞用直接传代法或离心法传代。
【实验用品】
1.器材；细胞培养仪器与原代细胞培养相同。其他用品有培养瓶、离心管、吸管、移液管、各类橡皮吸头和胶塞、酒精灯、试管架、酒精棉球等。
2.试剂：M199培养液(含小牛血清和青、链霉素等)、0.25％胰蛋白酶溶液、Hanks液、7．4％NaHCO3。
3.材科： HeLa细胞或原代培养细胞。 【实验方法】
1. 贴附生长细胞的传代
1) 清洗细胞：取已长成或接近长成致密单层的细胞，倒去培养液，加入2—3m1 Hanks液．轻轻振荡清洗细胞，以去除残留的血清和衰老脱落的细胞及其碎片。
2)消化：加入适量(盖满细胞面即可)0.25％胰蛋白酶溶液，室温下(或37℃)消化2—3min后，倒置相差显微镜下观察细胞单层，待细胞成片地收缩，出现许多空隙时即可倒去消化液(如消化程度不够时可延长时间)。再加Hanks液轻轻洗一遍后倾出或直接进行下一步操作。如在酶消化过程中，见细胞大片脱落，表明消化过头，则不能倒去消化液（以免丢失细胞），需加入等量的培养液吹打、收集细胞，800r／min离心5min后弃上清液后再进入下一步。
3)接种；在培养瓶中加入3m1培养液，以终止消化。用吸管反复吹打瓶壁上的细胞层，直至全部细胞被冲下。轻轻吹打混匀，制成单细胞恳液，按1∶2或1∶3分配，接种到2—3个培养瓶内，再向各瓶补加培养液到5ml。也可以取细胞悬液
计数，分别按需要的细胞浓度接种到其他的培养瓶中，再补足培养液进行培养。
原代培养的细胞首次传代时，细胞接种数量要多一些，以使细胞尽快适应新环境，利于细胞生存和增殖。随消化分离下来的组织块也可一并传人新的培养瓶。
4)观察：细胞传代后，每天应对培养细胞进行观察，注意有无污染、培养液的颜色变化、细胞贴壁、生长情况等。
2. 悬浮生长细胞的传代
直接传代即让悬浮细胞缓慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1／2—2／3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。
1)在超净工作台内用小吸管(弯头)将培养瓶中的细胞吹打均匀，尤其是将那些半贴壁的细胞吹打起来。
2)吸入离心管中，盖紧胶盖，与另一离心管平衡后置离心机中800—1000 r／min离心 5min。
3)回到超净工作台操作，弃上清液，加入适量新培养液，用吸管混匀，制成悬液。
4)按1：2或1：3分配传代培养。也可以计数后根据所需要的细胞浓度传至新的培养瓶或培养皿中，放入温箱继续培养。
【作业】
1. 记录细胞传代过程和细胞生长情况。 【思考题】
1．简述贴附型生长细胞传代培养的主要方法和步骤。 2．为什么培养细胞长成致密单层后必须要进行传代培养?
实验七 细胞的计数方法
【实验目的】
1.掌握培养过程中细胞计数方法。 2.熟悉培养细胞存活率计算。 【实验原理】
在细胞培养过程中，细胞恳液制备后，需要进行细胞计数，以确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数。
【实验用品】
1.器材：与细胞培养相同，细胞计数板、细口滴管、绸布。 2.试剂：培养用液同上，0.4％台盼蓝。
3.材料：培养细胞悬液、冻存细胞复苏后的细胞悬液。 【实验方法】 1. 计数板准备
用无水乙醇或95％乙醇溶液冲洗计数板后，用绸布擦净，另擦净特制盖片一张，把盖片覆在计数板上面。
2．加细胞悬液
用无菌细口吸管吸取一滴细胞恳液(细胞悬液也可先进行稀释，计算时应乘以稀释倍数)，从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡．否则要重做。该吸管加完样后不能再用。稍候片刻．将计数板放在低倍镜下(10×10倍)观察计数。
3．细胞计数
按图计算计数板的四角大方格(每个大方格又分16个小方格)内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过土5％。
5．计数的换算
计完数后，需换算出每m1悬液中的细胞数。由于计数板中每一大方格的面积为0.01cm，高为0.01cm，这样它的体积为0.0001cm即0.1mm。由于1ml＝1000mm，故可按下式计算：
细胞悬液细胞数／m1=4个大格细胞总数×10000
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