实验三 显微摄影技术
显微图像是细胞学研究中不可缺少的内容。随电子技术和数字化信息业的发展，使显微图像的记录更方便、快捷、真实，其中摄影记录显微图像是最简单、经济、有效的方法，也是结合其他辅助手段深入分析处理图像的前提。
【实验目的】
(1)了解显微摄影装置的工作原理和操作步骤。 (2)了解黑白胶片冲洗和放大技术。 【实验器材】
(1) 器材：显微摄影显微镜、135全色胶卷、滤色片、黑白放大机、显影罐、定时钟、显、定影盘、竹片夹、3号放大纸、上光机、切纸刀、塑料盆。
(2) 试剂：D72、D76显影液、F5酸性定影液。 (3) 材料：标本片或培养细胞。 【操作方法】 1.显微摄影装置
显微摄影装置最基本的结构就是：显微镜十照相机。为了提高效率和效果又增加了一些辅助装置，如：摄像目镜、调焦取景目镜、测光装置或自动感光装置等。
简单的摄影装置就是将普通照相机架在显微镜的目镜上方，照相机镜头前镜片正好在显微镜的出眼点略上一点，即可拍摄到标本的图像。
实用的装置是在显檄镜的目镜座上方分出一个光路，装入专用摄影目镜，再装上一个相机机身(即无镜头的相机)。这样观察标本与拍摄互不干扰，工作效率提高。由于相机直接固定在显檄镜上，又用了专用的显微摄影目镜，所以效果更好。
在较好的摄影装置中加还装了测光系统，可提供感光量参考值；有的还有自动控制感光装置，似“傻瓜”相机，以图像亮度自动设定感光时间，并据此开启快门曝光。
再高档些配有记忆感光，多张胶片按相同感光量感光，常用于较大面积的分区摄影；重复感光，在一张胶片上多次感光，把不同视野中的图像拍在同一张底片上，便于比较观察。
2.胶卷的分类
用于显微摄影的理想胶卷应该是：高分辨力、大反差、色饱和度高而颗粒细，感光灵敏度高。
1）胶片的分类
(1)按色彩分：彩色和黑白的。
(2)按尺寸分；135、120、等。
(3)按感光灵敏度分，高感光度；低感光度。 (4)按成像性质分：负片和反转片。 (5)按色彩要求分；日光型和灯光型。 3．胶片的选择
可分为黑白胶卷和彩色胶卷，可根据拍摄材料需要进行选择。
1)一般选用黑白胶卷，其优点是清晰度高，效果易控制、操作筒单、保存长久。彩色胶片适用于表现复杂色彩的标本，可鲜明、真实地显示要观察的结构，但效果较难控制。
2)尽管负片尺寸越大效果越好，但135胶卷在分辨力、机械强度方面巳相当不错，能胜任大比例的放大。所以，一般选用135胶卷。
3)对于显微摄影来说，选用高感光度的胶卷是要经常考虑的。显微图像反差弱，色泽暗淡、贫乏，清晰度低，亮度低等是其先天的不足。看前三个因素，应选低感光度胶卷。它反差系数大，色饱和度高，清晰度好。而看第四个因素，却应选高感光度胶卷，但它的反差系数小，色饱和度低，清晰度差。综合考虑，在感光度能达到要求的范围内，越低越好。当然，有些情况必须用高感光度胶卷，如亮度太低的荧光标本、运动速度较快的细胞运动等。
4)负片与反转片都常用于显微摄影。对彩色片来说，负片的品种较多、经济、感光宽容度大，易操作等，但由于条件所限，无法自己亲自扩印，只好由彩扩部门代为制作。而他们不了解显微图像的特殊性、往往得不到满意的照片。尽管反转片较贵，操作较严格，但它的感光量，色彩还原，能被显微摄影者直接控制，能按自己的意图，呈现画面，色饱和废高，层次丰富，若经济及技术条件许可，应作为首选。
4.光源
显微镜的光源多是钨丝灯．此时应选用灯光型彩色片。但灯光型的不易买到。也可用日光型的代替，但应在光路中加滤色片以调整色温。
5.显微摄影装置的使用
常用的显微摄影可分两种，一种是在摄影光路分出一个侧目镜。调节此侧目镜的调焦环至其中的双“十”字的线条呈分开的双线(四对)，此时看到的标本图像就是将在胶卷上被记录下来的状态。另一种是不带侧目镜的，而是在观察目镜中有一片带格标尺，调节观察目镜上的调焦环至有格标尺清晰，在此看到的标本图像就是将在胶卷上被记录下来的状态。另外，可根据需要来设置感光度、快门时间或自动曝光、重拍、连拍、数值记录等。这些装置在摄影系统上都较直观，易操作。
6.滤光片的选择
显微摄影对滤光片的使用比一般观察时要重要的多，配合得不好，会使拍摄效果大失水准。（尤其是彩色摄影时滤光拍摄黑白胶卷时），为了达到最高分辨力和反差，应选用与标本颜色互补的单色浊光片。如红色的标本选用蓝色滤光片，紫红色的标本选用绿色滤光片等。较简单的方法是：换用各种颜色的浊光片观察一下，镜下的视觉与将在胶片上形成的效果相似。
拍摄彩色胶卷时，使用滤光片要考虑的因索较多。如，用灯光做光源的显微镜，选用日光型胶卷时，在光路上要加蓝色滤光片(如雷登80A型滤光片)把光线色温从3200K左右提高到5500K左右，适合于日光型胶卷对光色温的要求。否则，拍出的照片会偏色。滤光片的选择要根据需要的效果、所用的标本状况，光源性质和胶片持性等灵活掌握。例如，显微荧光摄影时，虽然用的是灯泡光源，但却不是发3200K色温的普通钨丝灯泡，而是高压汞灯，发出的是短波长光线，靠它激发产生荧光，故不能再加任何摄影用滤光片；再如用相差显微镜拍摄时，标本往往是无色透明，但在相差显微镜下呈现黄绿色，较适合人的视觉心理正色温。否则，反而感到不真实。
7.显微摄影需重视的几个问题
1)选择质量好的标本图像，这是拍摄到满意照片的前提，应引起拍摄者的高度重视。
2)要选择合适的感光材科。
3)严格地调整显微镜，调整不当所导致的不良现象，在普通观察时不易察觉到。但在照片上的差异却持别引人注目，如视野内亮度不均匀。
4)选用合适的滤色片。
5)调焦要准。包括两个方面，一是对目镜(侧目镜)的调焦，二是对物镜的调焦。
6)光线强度要适当，使标本图像的反差，色彩饱和度达到满意。 7)感光过程中应绝对避免振动，否则会导致记录图像的模糊。
8)感光更正确。测光表提供的感光时间仅是参考。尽管多数情况下此值与正确感光值是一致的。如暗背景的感光量应比测得值减少1—2倍；明视野背景下的很小面积的图像时(如拍摄染色体散开)应增加1—2倍。
8.暗室技术
一般地说，彩色片(包括负片和反转片)必须送到专业店去冲扩。而黑白感光材料处理容易，效果易控制，出样快等，适合于就地冲扩，被大多数实验室所采用。
1）感光纸
根据反差系数大小分为：1号—反差系数小，适合制作低反差照片，层次丰富；2号—反差系数适中；3号—反差系数大，一般的细胞结构照片可采用它，4
号—反差系数最大，层次少，适合于制作黑白分明的结构照片，如染色体，电泳等。
黑白感光纸，对红光迟钝，可在较暗的红灯下操作(如＜15w)但绝非不感红光。所以，不能距红订太近(最好大于0.5米)。
注意，除感光纸之外，感光材料大都感受所有光线。所以，黑白全色胶卷，各种彩色负片，彩色反转片均不能在红光下打开暗盒，否则．就报废了。
2）显影液及定影液
显影液和定影液的种类很多。黑白照片冲印常用显影液有两种，定影液一种。胶片显影常用D76，相纸显影常用D72。定影则常用F5。除非是很待殊的情况，不必再选择其他种类的配方，用不熟悉的配方，反而不易控制。上述显影和定影液配方如表3-1和表3-2所示。
表3-1 常用显影液配方（用途：胶卷、相纸）
药品 米吐尔 无水亚硫酸钠 几奴尼(对苯二酚) 硼砂(四硼酸钠) 碳酸氢钠 溴化钾 水
表3-2 常用的酸性定影液（用途：胶卷、相纸）
硫代硫酸钠 无水亚硫酸钠 36％乙酸 水
3）冲洗胶卷
建议用显影罐冲洗，此法效果稳定，稍加训练后，就可把握。在全黑暗的环境中(如暗室或暗袋中)，将胶卷装入显影罐。注入显影液后要拍打一下罐体，以驱赶掉附着在胶卷上的气泡；而后转动胶片轴，每分钟正反转动2次，使液体有可能循环；到时间后倒出显影液，注入定影液，常搅动。而后倒出定影液，开盖，自来水流水冲洗10min，挂起晾干。
240g 7.5g 21m1 1000ml
D72 2.0g 100g 5g 2g 1000 ml
D76 3.1g 45g 12g 76.5g 1.9g 1000ml
4）印放照片
一般在暗室中红灯光下操作(以放大为例)。
(1)调焦：把底片放入放大机后，打开光源，将镜头光圈打到最大(此时亮度大，易准确调焦)，升降放大机和镜头，直到图像大小合适、细节清楚。收小光圈2—3档(此时图像效果最好)。
(2)试小样：用一张较小的放大纸，用多级感光方法，如：先感光5s，遮住1／3面积，再感光5s，再进一步遮住2／3面积感光5s。这样一张放大纸上有三级感光量，显、定影，选出合适的感光时间，就可正式故大照片。
(3)放大照片的基本技术：①裁剪画面：选合适的区域，放置同样大小的相纸，就可以得到仅有画面某一区域的照片。②边挡面画：在放大感光的过程中，用遮挡光线的方法，使不需要的区域无感光或过度感光，此区域就是呈现白的或黑的，达到不显示此处画面的目的。③叠放画面；将需要比较的两个(或多个)画面的底片放在一起放大，照片上的两个结构精细且极有说明力的图像可同时表现出来。
(4)定影完毕的照片，要用流水冲洗15min(比胶卷稍长，因纸质吸的药品较多，不易洗净)以上，然后用上光机烘干上光。
(5)注意事项：
①底片在放大机中不要拉动，以免划伤药膜面，造成白或黑斑。 ②感光过程．严防振动，以免照片图像发虚。
③显影液的温度和时间不要偏离参考值太远，要试小样。有时往往图省事不按要求做，结果反而更麻烦。
④需要长久保存的底片，照片一定要定影透彻．水洗彻底，否则，过一段时间，照片会发黄。
【作业】
1．拍摄体外培养的细胞，并冲洗放大黑白照片一张。 2．感光胶卷有几大类？显微摄影时应如何选择？ 3．取得好的照片的关键因素是什么？