300
μL水洗脱。
1.3.2 逆转录、扩增与标记 取10μL病毒RNA提取液,加入1μL0.2μL/mLPrimerD(GTTTC2CCAGTAGGTCTCNNNNNNNN),混匀,离心后70℃,5min,迅速冷至0℃后,离心,加入相应缓冲液、RNA抑制剂(Fermentas,RevertAidFirststrandcD2NAsynthesiskit)及dNTPs(终浓度为1mmol/L),混匀,离心后25℃,5min,加入1μLM2MuLV逆转录酶并补水至总体积为20μL,混匀,离心后25℃,10min,42℃,60min。逆转录结束后,95℃,3min,再冷至10℃,加入5USequencenase2.0(Amer2shamBioscience),混匀,离心后25℃,5min,37℃
,8min;70℃灭活10min。
PCR扩增:参照文献方法[3],50μL的PCR反L上述反应产物为模板,加入扩增应体系中,取5μ
引物E(GTTTCCCAGTAGGTCTC),按下列参数扩增:94℃预变性3min,94℃变性30s,40℃,30s,50℃,30s退火,72℃,延伸60s,进行40个循环后,补入1UTaq酶,继续20个循环。PCR产物用QIANGENPCRPurificationKit纯化,最后用30号,而且不同亚型之间基本没有假阳性信号,表明用
此种方法可以广谱地鉴定出流感病毒的相关亚型
。
图1 流感病毒甲1
型芯片检测结果
2 乙型流感病毒芯片检测结果
水洗脱。
μL探针荧光标记:取0.2μg/μL),混合后沸水浴变性30℃,在50μL体系中加入9UKlenowminus酶(Promega),1μL1mmol/LCy5dCTP(AmershamBioscience),1μL1mmol/LdCTP,5μL1mmol/LdCAP,dGTP,dTTP混合物,加入酶缓冲液和水至终体积50μL,混匀,离心后42℃,120min。反应产物用QIANGENPCRPurifica2tionKit纯化,最后用30μL水洗脱。1.4 杂交与扫描 杂交方法参照文献[4]并作适当调整:取5μL标记产物,加入5μL2×杂交液(6×SSC,0.2%SDS,5×Denhart溶液,10mg/mL鲑鱼精DNA),沸水浴变性3min,迅速冷至0℃,取10
3 讨论
现有的病毒芯片检测技术,绝大部分只能针对一类病毒,通过特定引物来扩增病毒样品,然后通过芯片杂交来确定亚型,但是通过基因芯片来同时检测几种病毒及其亚型,很少见有报道。我们根据David所报道的方法[3],设计了针对呼吸道病毒的检测探针。探针的设计原则是:尽可能选取每个病毒家族的最保守序列作为检测探针。将每个病毒基因组利用软件分成有25nt重叠的70nt长的寡核苷酸片段,利用BLASTN排序分析每个70nt长的寡核苷酸片段与同家族(或同组)病毒的同源性,选取同源程度最高的片段作为该病毒的检测探针。通过同源杂交,可以尽可能多地检测到同家族内未知的或未测序的病毒。其次,对待检样品的扩增方法也做了改进。一般病毒芯片检测技术,都是设计特定的病毒相关引物,将病毒特定序列进行扩增。因此,对于病原未知的样品根本无从下手。而我们所用的方法是,待检样品先通过由带扩增标签的随机引物(5’2GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN)在聚合酶催化下进行2次随机延伸,使其两端带上扩增标签,再由相应的扩增引物(5’2GTTTCCCAGTAGGTCTC)进行PCR扩增,其结果相当于
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μL滴于点样区,盖上盖玻片防止挥发(不要有气泡),放入杂交仓,置于湿盒内,55℃杂交120min。结束后分别用0.1%SDS和水洗涤并干燥,将芯片置ScanArray5000(GeneralScanning,Inc.)中,在特定区域上扫描。2 结果
图1和图2分别是流感病毒甲1型和乙型流感病毒细胞培养上清的芯片检测结果。由图可以看出,在芯片的相应探针位置都有很强的阳性杂交信