3、加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀，8 000 g离心10 min。 4、吸取上清液，加等体积CHCl3，轻轻振荡混匀，5 000 g离心20 min。 5、重复步骤4一次。
6、以下步骤同“外周静脉血DNA的提取”。 三、羊水细胞DNA的提取
1、取羊水20 ml，于4℃、3 000 g离心15～20 min，除去上清液，用生理盐水洗涤沉淀的羊水细胞2～3次，冻存于液氮中或立即提取DNA。
2、绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆；向羊水细胞中加STE至500 ml，加SDS至终浓度为0.5%，加蛋白酶K至100 mg/ml。37℃水浴过夜，期间振荡2～3次。
3、加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀，8 000 g离心10 min。 4、吸取上清液，加等体积CHCl3，轻轻振荡混匀，5 000 g离心20 min。 5、重复步骤4一次。
6、以下步骤同“外周静脉血DNA的提取”。
【应用】
遗传病的诊断、遗传病的家系系谱分析、人类基因组资源的保存、以及一些具体研究领域的前期工作。
【注意事项】
1、外周静脉血一般用医用ACD抗凝，也可用EDTA抗凝。因肝素能抑制限制性内切酶活性，故一般不采用肝素抗凝。
2、因Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）、氯仿（CHCl3）有较强的毒性作用，在操作过程中应注意防护，防止液体溅到皮肤上，有条件的可以戴乳胶手套以及口罩，保持良好通风。
3、在酚以及氯仿的混合过程中，注意轻轻混匀，切忌剧烈震荡，防止
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DNA因机械剪切而发生断裂。
4、无水乙醇沉淀DNA的过程中，注意使用室温的无水乙醇，不需要预冷，否则RNA容易析出。
5、不要使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解。可以将其置于摇床平台上慢慢摇动至DNA完全溶解。
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实验十三 聚合酶链式反应（PCR）
【实验目的】
1、了解PCR技术的原理；
2、掌握PCR技术的程序和步骤。 实验原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在体外模拟DNA的复制过程，经过变性、复性、延伸三个过程，在一对附加的引物之间诱发聚合反应，短时间内可将要研究的目的DNA扩增数百万倍。
PCR技术操作简单，灵敏度高，对模板DNA的质量和数量要求较低，常规方法提取的DNA和RNA都能满足PCR扩增需要，可在普通实验室完成，结果较为可靠。
试剂与材料
1、样本DNA、上下游PCR引物、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/ml）。
2、微量加样器、PCR自动热循环仪。
【实验步骤】
一、样品的收集及处理
用于PCR反应的样品可以是已提取的各种来源的DNA分子，也可以选取经处理后的全血、羊水、绒毛。
（一）全血
1、取全血200 ml用EDTA抗凝。 2、5 000 g离心10 min。
3、弃掉上清液，沉淀重悬于200 ml无菌三蒸水中，煮沸5 min裂解细胞和细胞核。
4、5 000 g离心10 min。
5、取上清液30 ml，直接进行PCR扩增。 （二）绒毛
1、取绒毛样本，8 000～10 000 g离心2 min，使样本沉降到管底。 2、用STE缓冲液洗两次。
3、重悬于50 ml裂解液中振荡裂解。 4、煮沸2～3 min，5 000 g离心10 min。 5、取上清液2.5 ml，进行PCR扩增。
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（三）羊水
1、取1.5 ml羊水，8 000～10 000 g离心5 min。 2、弃上清液，沉淀用TE缓冲液洗一次。 3、在细胞沉淀中加50 ml裂解液振荡裂解。
4、煮沸2 min，再次震荡；5 000 g离心10 min。 5、取上清2.5 ml，进行PCR扩增。 二、PCR扩增
1、25 ml标准PCR反应体系各成分终浓度如下： 模板DNA50～100 ng
Taq DNA聚合酶0.5～1 U 4×dNTPs20～200 mmol/L Mg2+0.5～2.5 mmol/L 引物各0.1～0.5 mmol/L
2、标准PCR反应循环参数： 95℃ 5 min预变性； 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s（可根据扩增片段长度决定，一般为1 kb/ min），共30个循环；
72℃ 7 min。
【结果判断】
多采用琼脂糖凝胶电泳法，根据PCR产物的片段长度，选用1.5%～2%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间一般为30～60 min，检测PCR扩增产物。
【应用】
PCR反应在分子克隆和DNA分析中具有多种用途，例如，某些特异性探针的制备，突变的分析，生成大量DNA进行序列测定，遗传病的诊断分析等。
【注意事项】
1、Taq DNA聚合酶在使用时，要注意在冰上操作，并且可以将大包装分装成独立的小包装，减少污染机会。
2、PCR反应极其灵敏，痕量的DNA污染也可能会造成非特异性扩增，所以避免外部DNA污染是很重要的。
3、PCR反应中，DNA扩增片段的增加随着循环次数的增加会出现停滞效应，即平台期，30个左右的循环即可达到平台期，超过平台期的循环次数会引起非特异性扩增。
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实验十四 DNA的琼脂糖凝胶电泳
【实验目的】
1、了解琼脂糖凝胶电泳检测DNA的一般原理； 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测技术。
【实验原理】
DNA分子携带负电荷，在一定电解质缓冲液存在的条件下，它可以以不同孔径琼脂糖为支持物由电源负极向正极移动。琼脂糖电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的常规方法。琼脂糖凝胶可以灌制成各种形状、大小和孔隙度。参数的选择主要取决于所分离片段的大小。
琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200 bp至近50 kb的DNA。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。少至1～10 ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。
【试剂与材料】 1、琼脂糖、5×TBE或TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙锭（储存液10 mg/ml）。
2、稳压电泳仪、水平凝胶电泳槽、紫外线检测摄像装置。
【实验步骤】
1、根据所需浓度称取一定量的琼脂糖，加入一定体积的0.5×TBE或1×TBE或其它电泳缓冲液，如TAE。
2、加热溶解琼脂糖。 3、溶液冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5 mg/ml。 4、把制胶模具摆放好，插上梳子。
5、将琼脂糖倒入模具，凝胶厚度一般约为0.5 cm。
6、室温下放置30～45 min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子，将凝胶放置于电泳槽中。加样孔位置在负极。
7、加入电泳缓冲液（与琼脂糖凝胶的离子强度一致）至电泳槽中，让液面高于胶面1 mm。
8、在DNA样品中加入1/6的上样缓冲液，混匀后，用移液器将DNA样品加入样品孔中。同时将DNA Marker准加在两侧的空样品孔中。
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