实验三 人类染色体G显带技术
一、实验目的
1、了解人类染色体G显带技术方法 2、掌握镜下各号染色体G带带型。
二、实验原理
人们利用不同的方法和染料处理染色体标本后，可使每条染色体上出现
明暗相间，或深浅不同的带纹，称为显带技术。这一技术的应用，可以准确识别23对不同类型的染色体，并能识别同一号染色体上的不同区带。从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床上某些疾病的诊断提供了有效的手段。上世纪70年代以来，显带技术得到很大发展，人染色体经胰蛋白酶或EDTA（乙二胺四乙酸二钠）等试剂处理后，再用Giemsa染料染色，染色体上出现深浅交替的横纹，即染色体的G带。在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带、N带），G带是应用得最广泛的一种技术。因为G显带技术具有设备要求低、试剂便宜、G显带标本稳定而易于保存及观察方便等优点。
关于G带的形成机理，迄今尚不十分清楚。有人认为，在胰酶的作用下，蛋白质不均匀丢失是G带产生的原因。在染色体上的蛋白质经处理而丢失后，这些区域呈现出浅染(浅带)。染色体上蛋白质和DNA结合牢固的区域，由于蛋白质丢失少而呈现深染(深带)。还有人认为，染色体经蛋白酶消化后，染色体的核蛋白破坏，这些区域裸露的DNA分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为，染色体上T—A和C—G碱基的含量和分布不同，也与染色体上深浅带的形成有关。A—T碱基对较多的区域，易与吉姆萨染料结合而染成深色区带；而G—C碱基对较多的区域则相反，染成浅染区带。总之，目前说法较多，但主要概括了三种观点，即显带是由于:①DNA的作用；②蛋白质的作用；③DNA、染料和蛋
- 12 -
白质三者之间相互作用的结果。这些都有待于进一步研究探讨。可以肯定，G显带具有很多优点，如制备方法简便易行，标本可长期保存，带纹清晰，成本低廉，制备周期短，普通光学显微镜即可观察。故已成为当今细胞遗传学与分子细胞遗传学领域中应用广泛的一种技术，并成为研究分析染色体的主要常
规方法之一。
三、实验用品
1、器械：恒温水浴锅、温度计、60ml立式染色缸、吸管、滴头、电吹风。 2、试剂： 0．02％胰酶溶液、0．4％酚红溶液、1NNaHCO3 、10%Giemsa 染液、 pH6．8磷酸缓冲液、 0．85％NaCl溶液。
3、标本：外周血培养按常规法制作染色体标本（白片）。
四、实验内容
（一）、G显带标本制备
1、外周血培养按常规法制作染色体标本，置75℃烘箱烘2~8小时或置室温自然老化3~7天左右。
2、将0.02％胰蛋白酶溶液倒入染色缸中，加入0．4％酚红溶液2滴，并以1NNaHCO3调节PH 7.0 左右，使颜色为橙色。混匀后，置于37℃水浴锅恒温。
3、将经过老化的标本片投入0.02％胰蛋白酶溶液中消化30～60秒。 4、取出已消化的标本片，立即投入磷酸缓冲液中，冲洗残留的胰酶。 5、用10%Giemsa染液染色10分钟。 6、自来水冲洗，凉干或电吹风吹干后镜检。
（二）、镜检
先在低倍镜下选择分散良好、长度适中的中期分裂相，然后转至油镜下观察G带带型。选择带纹清晰的分裂相进行分析，并在作业与思考纸上绘出快速线条分裂相，标明各条染色体序号。
- 13 -
五、注意事项
1、G显带的好坏，首先取决于染色体本身制片的质量，染色体长度要适中，以早中期为宜，且中期相丰富、分散好，无胞浆背景。若染色体边缘发毛，为显带过头，若染色体上未出现带纹，则为显带不足，根据具体情况调整显带时间。
2、标本片龄不宜太长，片龄越长，细胞对胰酶处理的抵抗性越强，片龄过长的标本染色后会导致斑点状而非带纹。
3、酶温度和处理时间需控制好，一般胰酶处理时间不少于30秒。
[作业与思考]
1、
什么是G带？为什么说G显带是应用最广泛的一种技术？
2、镜下观察并绘出一G带染色体核型图，在每个染色体旁标明其序号。
- 14 -
实验四 人类染色体C显带技术
一、实验目的
1、学习C显带标本制作方法、了解C显带技术原理。 2、掌握C显带染色体的基本特征。
二、实验原理
用强碱溶液加热处理染色体标本使其DNA变性后，再以温热的盐溶液处理使其复性时，由高度重复DNA序列组成的染色体结构性异染色质区域的DNA复性速度要明显快于其它区域，因而易被Giemsa染液深染，在染色体上呈现出特有的着丝粒和次缢痕深染区，即所谓的C带，也称为着丝粒异染色质带。而常染色质只能显示较淡的轮廓。由于人类的第1号、9号、16号染色体长臂近着丝粒处为次缢痕区（结构异染色质区），Y染色体长臂远端也为异染色质部分，因此这些区域均可显示出非常明显C带，故此法可以准确鉴别第1号、9号、16号和Y染色体，还用于确定着丝粒的位置和数目，配合其它显带技术可鉴别部分染色体的结构异常，如双着丝粒染色体、环状染色体等。不同个体的染色体，其C带的大小和染色强度不同，可呈现出多态性，因此，C带技术在多态性研究和分析染色体来源等方面均有较大的价值。
三、实验用品
1、器材：玻璃染缸、滴管、烧杯、水浴锅。
2、试剂：0．2 N HCl、5％Ba（OH）2溶液、2×SSC缓冲液、Giemsa染液。
3、材料：按常规法制作的染色体标本。
四、实验内容 （一）、方法1
- 15 -
1、将标本放入已预温至60℃的5％Ba（OH）2 溶液中处理5分钟。 2、用预热到60 oC的自来水冲洗，以除去钡垢。
3、将标本投入预温到60 oC的2×SSC溶液中温育30~60分钟。 4、取出后用自来水冲洗干净。
5、用Giemsa染液染色10分钟，水洗，空气干燥，镜检。
（二）方法2
1、将制好的玻片放入 0.2 N HCl中15~30分钟后用自来水冲洗。 2、浸入预温至56 oC 的5％Ba（OH）2 溶液中处理10~30秒。 3、用预热到56 oC的自来水冲洗，以除去钡垢。
4、将标本投入预温到60 oC的2×SSC溶液中温育30~60分钟。 5、水洗后用Giemsa染液染色30～60分钟。 6、流水冲洗，晾干，镜检。
将干燥后的标本置显微镜低倍镜下观察，找到分散好的、染色体长度适宜的分裂相，换油镜观察。注意观察各染色体的着丝粒区深染，尤其是第1号、9号、16号染色体着丝粒区及次缢痕区深染，两者合在一起形成明显大的C带，Y染色体长臂远侧段约1/2～2/3区段深染，C带明显。第1、9、16号染色体和Y染色体长臂的C带具有多态性。
五、镜检
由低倍镜找到合适的细胞分裂相，然后换油镜观察。注意1、9、16号染色体的C带和Y染色体长臂的远端带有明显的形态变异性。C带标本的带型特征：
- 16 -