实验十一 遗传咨询
【目的要求】
1、通过对单基因病(或性状)的系谱分析，熟练掌握系谱分析的一般方法。 2、熟练掌握遗传病再发风险的估计方法。 3、熟悉遗传咨询的一般过程。
【实验原理】
遗传咨询是医师或从事医学遗传学的工作人员用遗传学和临床医学的基本原理，确定某病是否为遗传病、遗传方式、再发风险、如何防治等一系列问题，然后回答患者及家属提出的有关疾病的各种遗传学问题，并提出建议和指导。所以，从事遗传咨询的工作人员除具备临床医学的知识外，还必须具备医学遗传学的基本知识，了解遗传病与其它临床疾病的鉴别诊断，掌握系谱分析的原理和方法，熟悉遗传病再发风险估计等等。遗传咨询一般包括下列几个步骤：①询问、查体、实验室检查、收集家族史，绘出系谱图；②依据第一步获得的资料以及实验室的检查结果，判断某病是否为遗传病；③根据系谱分析判断遗传病的传递方式或可能的传递方式；④回答患者及有关人员所提出的各种遗传学问题，例如该遗传病的产生原因、诊断、预防、治疗及再发风险的估计等问题；⑤与患者及家属商谈，并帮助他们做出恰当的选择和确定最佳措施。遗传咨询是减少遗传病患儿出生的有效方法，对降低遗传病的群体发病率，提高人类的遗传素质具有重要意义，因此它是医学遗传学的一项重要研究内容。
【实验内容、方法】
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1、分析下列系谱，判断各系谱中单基因遗传病的遗传方式，并写出患者及其他各成员的基因型(图1～图5)。
2、某女曾生育过一先天愚型患儿，现再次妊娠，惧怕再生同病患儿前来咨询。应该怎样计算再发风险？
3、某种遗传病男女发病机会均等，而且发病的患者可出现在父母均正常的家庭中。现有一对表现都正常的姨表兄妹，准备结婚，虽然双方父母正常，但他们的舅表兄患有此病，所以前来咨询。
请问此病的遗传方式如何？
这对姨表兄妹都是携带者的可能性有多大? (3)他们婚后出生此病患儿的概率是多大?
(4)如果他们均为携带者，那么他们婚后生出此病患者的可能性有多大? 4、某男性，38岁，两次结婚，第—妻妊娠8次均于妊娠2个月左右流产，故离婚，与第二妻婚后，女方受孕3次亦均在3个月内流产。请分析流产的原因以及能否再次妊娠。
5、一对夫妇生有苯丙酮尿症(PKU)的患儿，他们听说是遗传病后，前来咨询，问题是：
(1)他们二人及家庭各成员中全无这种病的患者，这怎么能算遗传病呢? (2)是谁的问题?能不能治疗?他们再生一个孩子患PKU的可能性是多大?如何预防患儿的出生?
6、一对新婚夫妇，由于女方的弟弟患有白化病，害怕今后会生育白化病患儿前来咨询。
7、有一对外表正常的夫妇，怀孕4胎中，有两次流产，存活的长女表型正常，但其染色体数目为45条，存活的男孩是一个具有46条染色体的先天愚型患者。
(1)请解释男孩的发病原因。
(2)长女将来会发病吗？婚后会生出先天愚型患儿吗?如果能，是否能防
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止患儿的出生?
8、一对夫妇婚后，怀孕5次，其中4胎流产，1胎多发畸形。经细胞遗传学检查丈夫为倒位携带者，他们还能否生出正常的孩子?如果能，表型正常的孩子的核型如何?
9、一位青年准备与他的姑表妹结婚，他们认为在他们的家系中从来没有过遗传病的患者，他们结婚对后代不会有影响。请你从我国人群的遗传负荷是每人平均携带5个有害基因的角度说明他俩不宜结婚的原因。
10、如果苯丙酮尿症的群体发病率为0.0001，表兄妹婚后后代患苯丙酮尿症的概率有多大?是随机婚配的多少倍?
11、黑尿病(AR)的群体发病率为百万分之一，请问下列情况产生有病后代的概率是多大?
(1)两个正常的无亲缘关系的人结婚。
(2)一个患黑尿病的人与一个正常的无亲缘关系的人结婚。
(3)一个正常的人，其弟弟患黑尿病，他（她）与一正常的无亲缘关系的人结婚。
12、一位女性表型正常，父母和两个哥哥表型也正常，但因她的两个舅舅患有假肥大型肌营养不良症(XR)前来咨询。
(1)她是携带者的可能性有多大?
(2)如她与正常男性结婚，婚后生男孩的复发风险是多大?生女孩的复发风险是多大?
(3)如果她婚后生了一个患者，如再生育，则生一个正常孩子的可能性是多少?
13、Huntington舞蹈症为常染色体显性遗传病，25岁以前发病的占10％，40岁以后发病的占60％。一位25岁的男性，表型正常，其外祖父患有该病，他的母亲现已45岁，表型也正常，请问他是携带者的可能性是多少?他将来的子女获得致病基因的风险是多少?
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实验十二 人类基因组DNA的提取
【实验目的】
1、了解DNA提取的原理；
2、学会实验室常用的提取DNA的方法。
【实验原理】
从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行分子遗传学各项研究的先决条件。制备高质量DNA的原则是：尽可能保持DNA分子的完整；将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。哺乳动物DNA的提取通常是在有EDTA-Na2及SDS一类的去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚、氯仿抽提实现的。在Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）作用下，DNA被释放到上清液中，经过氯仿去蛋白、去酚（因为可有10%的酚溶于水）作用后，乙醇可使DNA分子聚合形成白色或无色絮状沉淀，从而获得粗提DNA。用这一方法获得的基因组DNA大小约有100～150 kb，适用于Southern分析、用λ噬菌体构建基因组DNA文库和PCR反应等。
【试剂与材料】
枸橼酸钠溶液（ACD）、生理盐水、细胞裂解液、蛋白酶K（10 mg/ml）、10% SDS，STE缓冲液（pH 8.0）、Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）、氯仿（CHCl3）、乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液（pH 7.5）。
【实验内容、方法】 一、外周静脉血DNA的提取
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1、采集外周静脉血3～4 ml于7 ml管内，加0.5 ml ACD抗凝。 2、加等体积生理盐水，轻轻振荡混匀；1 500 g离心20 min。
3、弃上清液；每管加5 ml细胞裂解液，轻轻上下振荡至透明；1 500 g离心20 min。
4、弃上清液；每管加入STE（pH 8.0）2 ml，蛋白酶K（10 mg/ml）20 ml，10% SDS 200 ml，置37℃恒温水浴箱内，消化过夜。
5、加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀；5 000 g离心20 min。 6、吸取上清液，重新抽提1～2次。 7、加等体积CHCl3抽提2次。
8、吸取上清液至一小锥形瓶中，加入3 mol/L乙酸钠至终浓度为0.3 mol/L。
9、加入2.5倍体积的无水乙醇，可见有白色絮状沉淀物，即为所提取的DNA。轻轻旋转锥形瓶，慢慢将DNA聚到一起。
10、吸出DNA沉淀，放入加有1 ml 75%乙醇的Eppendorf管内；12 000 g离心10 min。
11、弃上清液，室温干燥。
12、加适量（200～500 ml）TE缓冲液，置4℃保存，约2～4天DNA才能完全溶解。
13、用DNA/RNA Calcultor检测DNA的含量和纯度。 二、绒毛细胞DNA的提取
1、绒毛滋养层细胞及羊水细胞的获得：将绒毛细胞放入Hank’s液中，立即在显微镜下分离绒毛枝状物，用生理盐水洗去血污，然后冻存于液氮中或立即提取DNA。
2、绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆，加STE至500 ml，加SDS至终浓度为0.5%，加蛋白酶K至100 mg/ml。37℃水浴过夜，期间振荡2～3次。
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