7.2-7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min。贮于暗处备用。 ②平板培养基：将上述贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的2％伊红水溶液及0.5％美蓝水溶液加入已融化的培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。当混合好的培养基冷却至45℃，便立即将此种培养基适量（约15 ml）倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。 四、操作步骤
l．水样的采取
(1)自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
(2)池水、河水或湖水：应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存
2．细菌总数测定 (1)自来水
①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。 ②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。④培养基凝固后，倒置于37℃ 温箱中，培养24h，进行菌落计数。 ⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。 (2)池水、河水或湖水等
①稀释水样：取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。
6
一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。 3．菌落计数方法
(1)先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
(2)首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。
(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。
(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。
五、实验报告 1．结果 （1）自来水
（2）池水、河水或湖水等 2．思考题
（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？
7
（2）你所测的水源水的污秽程度如何？
（3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度，培养时间等）来测定水样总数呢？为什么？
实验二、实验室环境和人体表面微生物的检查
一、目的要求
1.证明实验室环境与体表存在微生物。
2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。 3．观察不同类群微生物的菌落形态特征。 4．体会无菌操作的重要性。 二、基本原理
平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养1～2d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。 三、器材
l．培养基：肉膏蛋白胨琼脂平板。
2．仪器或其他用具：无菌水，灭菌棉签(装在试管内)，接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤
每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。
l．写标签
任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源(如实验室空气或无菌室空气或头发等)，字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。
8
培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。
2．实验室细菌检查
(1)空气：将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。lh后盖上两个皿盖。
(2)实验台和门的旋钮
①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签：左手拿装有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞(或试管帽)，将其取出，将管口很快地通过煤气灯(或酒精灯)的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。塞回棉塞(或试管帽)，并将空试管放在试管梁上。
③弄湿棉签：左手取灭菌水试管，如上法拨出棉塞(或试管帽)并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，塞回棉塞(或试管帽)，并将灭菌水试管放在试管梁上。
④取样：将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。
⑤接种：在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝，再将棉签伸人，在琼脂表面顶端接种，即滚动一下，立即闭合皿盖。并按图27-2E和F，将原放棉签的空试管拨出棉塞(或试管帽)，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。
⑥划线：另取接种环在火焰上灭菌，按图3—3方法进行划线，整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。
3．人体细菌的检查
（1）手指(洗手前与洗手后)
①分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后(班级、姓名．日期)。 ②移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。
③用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。
9
(2)头发：在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到玻脂平板表面，然后盖上皿盖。
A.接种时，用左手将平皿开启一缝； B.棉签伸入平板接种；
C.用己灭菌并冷却了的接种环划线； D.第二部分划线； E.最后部分划线
(3)咳嗽：将去皿盖的琼脂平板放在离口约6～8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。
(4)鼻腔
①按照实验台检查法的步骤②和③，取出棉签，并将其弄湿。 ②用湿棉签在鼻腔内滚动数次。
③按实验台检查法的步骤⑤和⑥，接种与划线，然后盖上皿盖。 4．将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃培养箱，培养1～2d。 五、结果记录方法
(1)菌落计数 在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数l/4面积的菌落数。
(2)根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。
菌落特征描写方法如下：
①大小：大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。
②颜色：黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。 ③干湿情况：干燥、湿润、粘稠。 ④形态：圆形、不规则等。 ⑤高度：扁平、隆起、凹下。 ⑥透明程度：透明、半透明、不透明。 ⑦边缘：整齐、不整齐。
10