有功能的人类乙型肝炎病毒聚合酶的提纯与表达
摘要
目的 ：排除细胞质的因素，识别一种有效的方法，可以提炼有用的乙型肝炎病毒的聚合酶。
方法 : 完整的 HBV-POL（843个氨基酸） 的5’端 用多个组氨酸标记，在大肠杆菌体内高水平表达。缓冲液溶解HBV-POL,树脂层析法提纯。大多数重组的HBV-POL被洗提在有NP-40存在的100mmol/l的咪唑溶液中，一种弱的洗涤剂保持HBV-POL的活性。一种还原的药剂应用在HBV-POL的提纯过程中，保护易溶解的HBV-POL免受多余的二硫化物的粘连。
结果 :应用大肠杆菌大规模生产完整的HBV-POL。提纯的HBV-POL有稳定的反转录酶和DNA聚合酶的活性。提纯的蛋白高纯度且有反转录酶的活性。
结论 ：应用纯净的方法大规模生产HBV-POL,便于结晶化，详细研究其结构和机制。 这种提纯方法的能力能获得人类HBV-POL的一种酶地活跃形式 ，有助于研究药物去治疗人类的慢性肝炎。
介绍
HBV感染是全球的公众健康问题，据估算全球有350-400百万人被慢性感染，有很大一部分人最后患了威胁生命的肝的疾病，如肝硬化、肝癌或其他疑难杂症。HBV自我复制通过与翻译
相反的步骤，用聚合酶根据自己的基因组被编码。HBV-POL是个多功能蛋白质，有启动蛋白的活力，以及DNA聚合酶和反转录酶的活性，有RNA- H酶活性，但它是短的校对活性。大多数合格的治疗慢性肝炎的药物都是核苷酸反转录酶的抑制剂，就是把HBV-POL当作靶子。几十年用这种方法治疗效果已经受限，因此急需一种更快更容易更高效的药物去治疗这种病。
HBV-POL这种酶在不同的系统中表达以及对它大量的提纯是困难的。基于这些问题，治疗药物的发展不能取得令人满意的进步，这种酶的生物研究被引领。有一些群体成功的使这种酶在体外表达，并且表达完整，这种表达需要DDDP和RDDP的活性。人类的HBV-POL被表达是在体外的兔子网状细胞系统中进行的，体外表达的这种酶只有DDDP活性，没有RDDP活性。在大肠杆菌中有RDDP活性，它与一种蛋白结合了。有酶活力的HBV-POL在大肠杆菌被获得，但得需要GRP94的一种聚合酶陪同表达才行。但是这种没有分子伴侣陪同表达，稳定且大规模的完整HBV-POL被表达出来还没有人报道过。
在这项研究中，HBV-POL携带六个组氨酸在大肠杆菌中被表达。HBV-POL有大约2.5%的半胱氨酸剩余，是一个大分子，因此，这种蛋白被期望能进入体内。基于这个原因，所有的溶解产物被高浓度的SDS溶解。降低剂量进入体内，然后SDS被一种弱的洗涤剂替换在洗的过程中，最后靶蛋白被纯化。纯化的HBV-POL有DDDP和RDDP的活性。这是第一次在大肠杆菌中没有分子伴
侣或者其它助手HBV-POL得以表达。这种酶可能有助于药物发展在治疗CHB中。
原料和方法 质粒构造
肝组织来自慢性乙型肝炎的携带者，并有表面抗原，此患者曾做过切除手术。肿瘤组织被解剖，切成小块放在液氮中备用。组织中的DNA被提取。HBV-POL相关的的东西被加强，使用更专一的聚合酶。对于一个完整的的P基因需要：
CPNotIF01:GTTGCGGCCGCATAATGGCCCTATCTTATC
CPBstBIR01: ATTTTCGAATTCTCACGGTGGTTTCCA
大肠杆菌的转化
质粒pTrcHis-A-Pol被化学转变在有决定权的DH5α的细胞中，此细胞由Real Biotech公司供给。IPTG加入到5ml的过夜的大肠杆菌中，最终浓度为1mmol/L，分别孵化4、8、12、16小时, 分别保存在 18℃, 24℃,30℃, 37℃ 和42℃下。 离心法获得细胞，在裂解缓冲液中混匀。蛋白质的表达水平由反-Xpress抗体决定。
组氨酸标记的HBV-POL的表达与纯化
被转化的细胞在100mL的LB肉汤中培养，直到培养达到OD600 0.6-0.8。添加IPTG使最终浓度为1mmol/L，在18℃下孵化8-10小时，并不断摇晃。感应的细胞通过离心法获得，在2000g 、20 min、 4℃条件下. 裂解-缓冲液体积与细胞
小粒的比率为4：1.溶菌液在室温下孵化30分钟，超声波降解10 × 10 s。在每一个音波下样本在冰中冷却5-10s。悬浮液在室温下离心30min，20 000 g 。悬浮在表面的物质需要转移到Ni-NTA树脂柱中，加入16ml的平衡缓冲液相平衡（和前面没有加裂解酶的裂解液组分相同）。树脂和浮在表面的溶菌液完全并缓和的混合 ，室温保存45-60分钟。树脂用8mL的洗涤缓冲液洗6-8次（50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.0, 0.5 mmol/L NaCl, 1% NP-40，10 mmol/L咪唑，20 mmol/L 2-mercaptoethanol，1 × Roche蛋白质抑制剂混合物）。用6 mL E-50,E-75,和 E-100 洗提缓冲液洗提HBV-POL片段（50 mmol/L磷酸盐缓冲夜, pH 8.0,0.5 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 1 × Roche蛋白质抑制剂混合物），将DDT加到收集管中使最终浓度为5 mmol/L。E-50, E-75,和E-100缓冲液中咪唑的浓度分别为50 mmol/L, 75 mmol/L and100 mmol/L,获得小片段洗提的HBV-POL，保存在-70℃。纯化的蛋白样品的浓度由一个BCA测试决定，以牛的血清白蛋白为标准。
Anti-反转录酶多克隆抗体的准备
在全长的聚合酶纯化前需准备RT多克隆抗体（数据不展示）。重组的RT（304-693个氨基酸）由大肠杆菌中提取。五十个微小纯化的RT和Freund’s完全辅佐物注射到小鼠的皮下。另一个50 μg纯化的RT和Freund’s在第一次注射后的两周注射。在第二次注射两周后处死小鼠，为了取血清中
的anti-RT多克隆抗体。用ELISA检测抗体滴定量和RT肽的比率，应大于1：32000.
SDS-PAGE, dot blot 和蛋白免疫印记法分析 全部的溶菌液和其他的洗提部分在95℃下加压5分钟。蛋白质用SDS-PAGE法分离。Gels 用Coomassie Blue染色。对于bot blot分析法，每个样本取1mL滴到硝化纤维膜上，此膜第一步需用稀释的1/4000anti-Xpress抗体和goat-anti-mouse共轭碱性磷酸酶处理。对于蛋白免疫印记分析，蛋白质转移到膜上，第一步需用稀释的1/4000anti-RT和goat-anti-mouse共轭碱性
HVB-POL的体外转录与翻译的表述
重组的质粒pT7-Pol用Qiagen Midiprep DNA纯化装备纯化。体外转录与翻译需用连接网状细胞的溶菌液系统TNTT7。两个小质粒DNA模板转录并翻译成蛋白质，无论有没有S标记的甲硫氨酸，在30℃、75分钟的条件下都能发生反应。加入0.1 mg/mL环己酰亚胺（用以检验聚合酶活性）或SDS样缓冲液（用以检验翻译效率）后体外翻译就停止了。体外翻译的蛋白质通过4%-12% SDS-PAGE分离开，在放射自显影之前先干燥。
DNA聚合酶活性和RT活性检测
DDDP 和 RT/RDDP的检测可以通过合成DNA，使用poly (dA) ? oligo (dT)12-18 和 poly (rA) ?oligo (dT)12-18
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