基于纳米自组装单分子膜的QCM传感分析研究
3.1 半胱氨酸的固定..........................................................................................................14 3.2 戊二醛修饰电极..........................................................................................................14 3.3 c-myc抗体的固定........................................................................................................15 3.4 c-myc蛋白的检测........................................................................................................15 3.5 修饰二抗......................................................................................................................16 3.6 传感器的再生..............................................................................................................18 3.7 实验方案的可行性分析..............................................................................................18 4 结论.....................................................................................................................................19 参考文献...................................................................................................................................20 致谢...........................................................................................................................................23 附录：图表的原始数据...........................................................................................................24
基于纳米自组装单分子膜的QCM传感分析研究
1 绪论
1.1 QCM概述
石英晶体微天平(QCM)作为纳克级灵敏度的称量工具，发展于20世纪60年代，最初主要应用于气相检测。直到20世纪80年代初，人们开始研究石英晶体在液体中的振荡行为。在压电石英晶体质量效应方程及压电石英晶体在溶液中的振荡规律得以总结和阐明之后，石英晶体微天平由于具有极高的灵敏度，能够敏感地测量微观反应过程中的微小变化并转化为可以定量检测的频率信号，因此其在化学传感器领域倍受青睐。
石英晶体微天平（QCM）最基本的原理是利用了石英晶体的压电效应：石英晶体内部每个晶格在不受外力作用时呈正六边形，若在晶片的两侧施加机械压力，会使晶格的电荷中心发生偏移而极化，则在晶片相应的方向上将产生电场；反之，若在石英晶体的两个电极上加一电场，晶片就会产生机械变形，这种物理现象称为压电效应。如果在晶片的两极上加交变电压，晶片就会产生机械振动，同时晶片的机械振动又会产生交变电场。在一般情况下，晶片机械振动的振幅和交变电场的振幅非常微小，当交变激励电压的频率与石英晶体的固有频率相同时，形成压电谐振。振幅变大，若石英晶体表面沉积了一定质量的物质，其振荡频率就会发生相应变化。电路的振荡频率等于石英晶体振荡片的谐振频率，再通过主机将测的得谐振频率转化为电信号输出。以上述理论为基础，得出Sauerbrey方程[1]：
?f?-Kf2?m/? 1-1
方程中，K为常数，f为质量变化前石英晶体本身的固有频率，即石英谐振器的基频(Hz)，△m 表示石英晶体晶振表面的质量改变值( g) ，也可以看作为被吸附物质的质量，A是石英晶体具有压电活性的表面积( cm2 ) ，即为被吸附物所覆盖的面积或是参与压电谐振的晶体面积。方程中的负号表明样品质量增加引起石英谐振器频率的降低。从以上公式可知：压电石英晶体振荡时，△f与△m 呈线性关系。通常将可选择性吸收待测物质的某种材料均匀地涂在压电石英晶体表面，得到一个基础频率f1，然后将其放到有待测物质的气体或液体中，压电石英晶体与被测物质作用而形成复合物，再对吸附了被测物质后的压电石英晶体进行频率测定，从而得到新的频率f2，振动频率的变化△f = f2 - f1，再根据Sauerbrey方程就可以得到被测物质的质量△m。虽然压电石英晶片的谐振频率在恒定条件下非常稳定，如普通石英钟的精度可达到年误差小于1秒，相对误差在千万分之
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一以下，但Sauerbrey指出，若在石英晶体的电极表面加上一小质量负载层，将导致晶振频率的显著下降。Sauerbrey将质量负载层等效于晶体的厚度增加，从理论上导出了晶体表面负载物质质量与谐振频移的关系即Sauerbrey方程[1]：
△F = - 2. 26×10- 6 F2△M/ A 1-2
式中，F为晶体的固有谐振频率（基频，Hz），△M为晶体表面涂层质量（g），△F为由涂层所引起的频率变化，A即为涂层面积（cm2）。对基频为9MHz的石英晶体，若取电极直径56 mm，由式（1-2）可知，1μg 的质量变化将导致645Hz的频率降低。由于频率测定可以达到很高的精度，估计检测限可达10-12g，因此振动的石英晶体是非常灵敏的质量检测器，并称作石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance, QCM）。从振荡电路频率测量信噪比考虑，易达到10-9g，因此石英晶体质量传感器也称为纳克微天平[2]。石英晶体金电极结构如图1-1所示。
图1-1 石英晶体金电极结构图
图中：Quartz Crystal—石英晶体 Base—底座
Gold electrode--金电极
由于结构简单、价廉、便于携带和对质量变化的高灵敏度响应，压电石英晶体传感器近年来发展迅速，已广泛应用于气、液态检测、医药实验诊断、食品卫生监督以及膜的形成机理研究等领域，成为化学传感器领域研究的热点之一。
1.2 纳米金自组装膜的简介和研究进展
1.2.1 自组装单分子膜
自组装单层膜（Self-Assembled Monolayers，SAMs）技术是自20世纪80年代以来快速发展起来的一个新型有机成膜技术。早在1946年就报道了表面活性物质在洁净金属表面上吸附而形成单分子膜的现象，并可用于气、液相色谱分离和酶的固定。20世纪
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90年代，自组装单层膜技术逐渐成熟起来。
自组装单分子膜是活性分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成的有序分子组装体系。自组装单分子膜可分为单层膜和多层膜。单层膜主要指以共价键和离子键为驱动力形成的，多层膜的组装方法主要是分子沉积技术和基于化学吸附的单分子膜技术。如图1-2所示，自组装单分子膜的形成基于长链有机分子在基地材料表面的强烈化学键合以及有机分子链间相互作用即通过固-液界面间的化学吸附或化学反应，在基片上形成化学键连接的、取向紧密排列的二维有序单层膜[3]。而与LB膜相比，其制备方法简单且具有更高的稳定性。SAMs从组成结构上可分为三部分[4]：一是分子的头基，它与基底表面上得反应点以共价键（如Si-O键或Au-S键等）或离子键结合，这是一个放热反应，活性分子会尽可能会占据基底表面上的反应点；二是分子的烷基链，链与链之间靠范德华作用使活性分子在固体表面有序且紧密的排列，相互作用能一般小于40kJ/mol，分子链中间可通过分子设计引入特殊的基团使SAMs具有特殊的物理化学性质；三是分子末端基团，如-CH3，-COOH，-OH，-NH2，-SH，-CH=CH2及-C≡CH等，其意义在于通过选择末端基团以获得不同物理化学性能的界面或借助其反应活性构筑多层膜。
图1-2 自组装单分子膜结构示意图
由于分子自组装合成的物质具有特殊的物理和化学性能，所以应用越来越受到各国
研究人员的重视。自组装单分子膜电子仪器制造、塑料成型、防蚀层研究等诸多领域都有实际应用。
1.2.2 纳米金概述
纳米金是研究较早的一种纳米材料，指金的微小颗粒，在生物学研究中一般将其称为胶体金。制备胶体金的方法有白磷还原法、抗体血酸还原法、柠檬酸钠还原法、鞣酸—柠檬酸钠还原法、乙醇超声波还原法等。最常用的为柠檬酸钠还原法，本论文采用的就是柠檬酸钠还原法。根据还原剂的种类和浓度的不同，可以在实验室条件下制备出不
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同粒径的胶体金，且方法简单、原料价廉。胶体金在510—550nm可见光谱范围内有一吸收峰，吸收波长随金颗粒直径增大而增加。当粒径从小到大时，表观颜色依次呈现出淡橙黄色（<5nm）、葡萄酒红色、深红色和蓝紫色变化[5]。纳米尺寸的金颗粒具有比表面积大、吸附力强、生物相容性好等物理化学特性，他在材料学、电子学、生物医药以及临床诊断等研究领域均有重要应用[6]。金纳米粒子由于良好的生物相容性和无毒副作用,近年来广泛应用于生物分析化学，在生物分子标记和检测、纳米生物传感器和纳米生物芯片等技术的开发和应用方面取得了重要的进展。 1.2.3 纳米金标记技术
纳米金标记技术（Nanogold labelling techique），实质上是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是纳米金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，而且吸附后不会使生物分子变性，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。
由于金纳米粒子可以和多种生物分子(核酸、蛋白质和生物分子等) 结合，易于标记，对人体无害，而且具有标记后被标记物活性基本不发生改变、不同直径的金纳米可以用于多重标记、在检测中样品用量极少、实验结果可以长期保存等特点被应用于生物标记检测。金纳米粒子作为特殊标记物进行生化分析的研究开始于20世纪60年代。1962 年Feldherr等[7]开始用金纳米标记细胞进行电子显微镜研究，1971年Taylor[8] 又将金纳米粒子引入电镜免疫技术中，开始将金纳米粒子用于免疫标记技术。目前，随着纳米技术的发展，金纳米粒子因其具有制备简单、粒径均匀可控、性质稳定等特点已成为纳米分析化学研究的热点，并已经发展成为第四大免疫标记新技术[9]。纳米金在蛋白质检测中的应用：
金纳米粒子标记蛋白质的原理，是由于金纳米表面带有较多的电荷，当蛋白质在pH 值等于或稍大于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质与金纳米相互之间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却很大，处于微弱的水化状态，较易吸附于金纳米颗粒的表面，从而获得金纳米标记的蛋白质[10]。例如，You等[11]用凝胶电泳、电动电位差、圆二色谱和荧光光谱研究了用金纳米标记修饰有不同基团的L-氨基酸与α-胰凝乳蛋白酶结合时的静电作用和疏水作用。Li[12]成功的利用发光金纳米标记羊抗人IgG。 （1）光学检测
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