基于纳米自组装单分子膜的QCM传感分析研究
金纳米粒子具有强荧光猝灭作用，能使荧光染料猝灭。基于此原理，Limei等[13]建立了一种基于金纳米粒子荧光猝灭测定抗原的方法。Jiang 等[14 , 15 ]利用金纳米的共振散射效应，检测载脂蛋白AI和载脂蛋白B，2个体系的线性范围分别为8.33～333.33 ng/ mL、1.97～197.17 ng/ mL，检出限分别为2.04 ng/ mL 和0.96 ng/ mL，此外，金纳米标记蛋白质所具有其他光学优点也引起了关注。例如，翟羽等[16]对金纳米标记的合成的核糖核酸酶与野生的核糖核酸酶进行光谱对比分析。 （2）电学检测
阳极溶出伏安法是电化学免疫分析中常用的分析方法。楚霞等[17]通过物理吸附将兔抗人免疫球蛋白G（IgG）抗体固定于微板上，与相应抗原IgG发生免疫反应后，再通过夹心模式捕获相应的金纳米标记的羊抗人IgG，然后再与金纳米标记的羊抗人IgG抗体和金纳米标记的兔抗羊二抗形成的免疫复合物反应，在微孔板上引入大量金纳米，用适当溶液溶解后可释放出大量的金离子，用阳极溶出伏安法检测。该方法的线性范围为1. 0～1143 ng/ mL，检出限为1 ng/ mL。将该方法应用于人血清中IgG浓度的检测并与传统的酶联免疫吸附分析法作对比结果基本一致。丁艳君等[18]以金纳米为载体标记蛋白A（PA）将补体C19抗体定向固定于石英晶体共振表面，用于压电免疫传感测定C19抗原。此方法克服了传统PA固定方法需要活化的缺点，具有固定抗体免疫活性高的优点，其线性范围为0.14～0.56μg/ mL，检出限为0.11μg/ mL。Walter等[19]用石英晶体微量天平传感器检测连有叶酸的蛋白质，该方法的检出限为50 pmol/ L。 （3）芯片检测
用于蛋白质功能及其相互作用研究的生物芯片，即蛋白质芯片[20] 。郭希山等[21]采用自组装膜的方法[22]将金纳米组装在双螺旋线微电极表面，并且在组装过程中利用金纳米对蛋白质大分子有良好的吸附能力实现抗体的固定化，然后进行特异免疫反应构成“三明治”结构的金纳米-抗原-抗体复合体，并与双螺旋微电极匹配形成三维纳米网络结构聚集体形成一种近似于“半导体”效应的“生物放大”机制，从而提高检测的灵敏度，该方法可以检测到10 - 10 g/ mL 的抗原，为蛋白质芯片直接检测提供了一种可行的方法。Savka等[23]先用对甲苯磺酰基修饰的磁性粒子探针分别与前列腺抗原、人体绒毛促性腺激素、α-甲胎蛋白结合后，再与金纳米标记的抗体结合生成“三明治”复合物。通过颜色变化判断复合物中的成分。3种抗原的检出限都达到了170 fmol/ L。
1.2.4 纳米金自组装单分子膜的研究进展
自80年代以来，有关自组装膜的研究渐渐成为科学研究的热点。近年来，由于纳
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米材料，特别是10nm一下的纳米材料特有的光学、电学、磁学性能，正日益成为科学家关注的焦点，有广泛的应用前景。1994年，Schiffrin等[24]巧妙地将自组装技术和纳米技术结合起来，提出一种两相相转移合成法。在制备纳米金的过程中引入了硫醇自组装膜，合成出自组装包裹的纳米金粒子。利用这种简单方法，得到了直径在5nm以下非常稳定的纳米材料。在纳米粒子表面构建自组装膜的分子，也早已不仅仅局限于直链硫醇类分子，还包括不同端基官能团的硫醇分子、异氰、脂肪酸、氨基化合物、氨基酸分子等。Mirkin等[25]将巯基官能化的单链DNA组装到金纳米粒子的表面。利用DNA的碱基配对将纳米粒子组装成二维或三维的体系。Caruso等[26]将聚电解质修饰在纳米粒子的表面，以这种纳米粒子为模板，在上面覆盖TiO2，得到壳-核结构的半导体纳米粒子。
1.3基于纳米自组装膜的QCM应用
1.3.1 纳米颗粒用于提高生物传感器的灵敏度
纳米颗粒（Nanoparticles，NPs）作为应用最为广泛的纳米材料，具有界面、尺寸、宏观量子隧道效应等诸多特性，非常适宜于生物检测应用研究，将其应用于QCM生物传感器，可显著提高传感器性能[27]。 （1）纳米颗粒作为载体固定敏感分子
若在QCM金电极的表面修饰层和敏感分子层之间再引入一层三维结构的NPs（图1-3 为NPs作为载体固定敏感分子原理示意图），利用NPs比表面积大、生物相容性好的特性，可提高生物敏感分子的固定量和固定活性。对于金属NPs来说，硫醇类分子是最简单的一种中介物质。硫醇类分子两端各带有一个活性基团，一端能与金电极结合，另一端携带能与NPs结合的基团，如巯基、氨基和羧基等。例如1，6-己二硫醇（1，6-hexanedithiol，HDT）可将纳米金颗粒（Goldnanoparticles，AuNPs）和金电极分别通过Au-S键结合起来。Wu等在QCM金电极上自组装HDT后固定AuNPs，结合巯基化的抗原检测日本血吸虫抗体，并加入辣根过氧化物酶标记的蛋白A分子进行信号放大[28]。
图1-3 纳米颗粒作为载体固定敏感分子原理示意图
（2）纳米颗粒作为标记物实现信号放大
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NPs自重较大且生物兼容性优良，以其作为标记物可使在检测相同浓度的待测物时，QCM生物传感器产生比特异性识别反应更大的检测信号（图1-4），提高QCM生物传感器的灵敏度。标记形式主要有夹心法和直接标记法两种，夹心法是NPs在QCM生物传感器中最常见的一种标记形式，即在常规检测的基础上引入以NPs标记的敏感分子（二抗或互补DNA链），如图1-4所示，将待测物“夹”在两个敏感分子间，从而达到放大检测信号的目的。吴灵等以α-甲基丙烯酸修饰的纳米磁球来标记抗体[29]，采用夹心法将抗原夹在两个抗体间来检测，使得检测信号放大了一倍左右，以此构建的压电免疫传感器对大肠杆菌O157∶H7的检测限为7. 9×102 CFU /mL。Chen等[30]在QCM核酸传感器中使用AuNPs以夹心法放大检测信号，使传感器对大肠杆菌O157∶H7的检测限降低了两个数量级。QCM生物传感器作为一种质量敏感型传感器，对于小相对分子质量待测物由于引起信号变化强度不足而难于分析，NPs 的引入可以放大检测信号，拓展QCM 的应用范围。Chu等以AuNPs-抗体作为第一扩增探针，以AuNPs-SPA和AuNPs-抗体的复合物作为第二扩增探针，进行树状扩增来检测免疫球蛋白[31]。研究结果表明，引入第一和第二扩增探针时各自的检测限为9.7和3.5 ng /mL，而未扩增时的检测限仅为10.9μg /mL。
图1-4 纳米颗粒作为标记物放大检测信号原理示意图
1.3.2纳米磁颗粒用于提高再生能力和缩短检测时间
若要使QCM生物传感器走出实验室获得实际应用，单单有良好的检测限是不够的，还需要具备响应迅速、操作简便和再生容易等其他特性，尤其是快速分析检测对于疾病的早期诊断与控制有着非常重要的意义。纳米磁颗粒的引入为此开辟了全新的视角。Li 等制备了Fe3O4为核、SiO2为壳的纳米颗粒，并将其与抗体共价交联，随后用永磁体将交联物固定在QCM金电极表面构成免疫传感器，对人免疫球蛋白的检测限为0.36μg /mL[32]。该传感器最大的特点是检测完毕后，纳米磁颗粒和免疫复合物层可以通过撤销磁场而简单移去，使传感器电极的再生变得十分容易。Pan等将适配体的高特异性和纳
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米磁珠的简便筛选性结合起来，以CCRF-CEM 细胞敏感型适配体标记纳米磁珠，实现对复杂样品中白血病细胞的快速检测[33]。
1.4 C-myc蛋白
人的c-myc原癌基因正常位于人染色体8q24，编码相关的c-myc蛋白。c-myc蛋白是最早被发现与肿瘤细胞增殖活性相关的原癌基因产物之一，定位于胞核中，它在胞浆内合成，与蛋白配基（主要是Max蛋白）形成杂合体后转移到胞核内，与特异性DNA序列相结合，进而激活或抑制许多靶基因的转录，导致细胞生长、凋亡和分化的改变。c-myc过度表达可改变细胞内的基因调控，使细胞易于转化为恶性表型，其他癌基因的活化或抑癌基因的失活均可启动或加速肿瘤发生。c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一，c-myc基因既是一种可易位基因，又是一种原癌基因，又是一种多种物质调节的可调节基因，也是一种可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因，myc基因在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及细胞周期的进程中起重要作用[34]。c-myc基因的异常表达是癌变过程中较早出现的分子改变，在不同的人体肿瘤细胞系中、包括粒细胞性白血病细胞系、视网膜母细胞瘤细胞系、某些神经母细胞病细胞系、乳腺癌细胞系、某些肺癌细胞系、人结肠癌细胞系，在骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、横纹 肌肉瘤都存在，c-myc蛋白与肿瘤的启动及癌性程度密切相关[35]。因此在线检测c-myc的含量变化，对于癌症的预防和诊治有着不可或缺的重要意义。
1.5 本文的研究内容
本论文是用L-半胱氨酸修饰电极表面，戊二醛共价交联法包被抗体，最后用纳米金标记二抗进行放大的方法检测蛋白，对压电免疫传感器进行了探索研究。首先在压电石英晶体金电极表面自组装一层带巯基的氨酸单分子膜，再在膜上组装一层戊二醛，通过吸附作用，将c-myc抗体固定于石英晶体表面。通过c-myc抗体与c-myc蛋白的特异性反应将c-myc蛋白固定于晶振表面，最后纳米金标记的二抗GAM放大抗原-抗体的识别信号。用QCM对纳米金标记的二抗和一抗识别的蛋白进行连续检测。纳米金标记二抗应用于QCM的研究相对较少，并且c-myc蛋白的检测对探索人的健康有很重要的作用。因此本论文通过用QCM检测c-myc蛋白实验探索本实验方案的可行性，为以后研究压电免疫传感器的优化条件和c-myc蛋白的检测方法、检测限做基础。
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2 实验部分
2.1 实验仪器与试剂
2.1.1 仪器
（1）CHI440A石英晶体微天平 (上海辰华仪器公司)
（2）8MHz石英晶振 （3）EQCM振荡器 （4）SP3165B型多功能计数器（5）CHI660D型电化学工作站 （6）KQ-100B型超声波清洗器 2.1.2 试剂
（1）柠檬酸三钠 （2）氯金酸 （3）L-半胱氨酸 （4）磷酸氢二钠 （5）磷酸二氢钠 （6）磷酸氢二钾 （7）氯化钠 （8）氯化钾 （9）30%双氧水 （10）浓硫酸 （11）盐酸 （12）乙醇 （13）巯基乙醇 （14）乙二胺 （15）戊二醛 （16）碳酸钾 （17）聚乙二醇 （18）叠氮化钠 （上海辰华仪器公司 晶体直径：13.6mm） （上海辰华仪器公司） （南京盛普仪器科技有限公司） （上海辰华仪器有限公司） （昆山市超声仪器有限公司） （AR，国药集团化学试剂有限公司） （AR，HAuCl·4H2O，≥47.8%，湖南试剂厂） （BR，天津密欧化学试剂开发中心） （AR，北京红星化工厂） （AR，上海新华化工厂） （AR，汕头市化学试剂厂） （AR，西安化学试剂厂） （AR，上海试剂一厂） （AR，上海桃浦化工厂） （AR，株洲石英化工厂） （AR，株洲石英化工厂）
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