基于纳米自组装单分子膜的QCM传感分析研究
（19）c-myc单克隆抗体：c-Myc (9E10)，美国Santa Cruz公司（货号sc-40），mouse monoclonal IgG, 200μg/ml，raised against amino acids 171-188 of c-Myc of human origin。c-Myc是人的一个转录因子，是一个蛋白；c-Myc (9E10)抗原是小鼠的免疫球蛋白。本实验所用的抗体原始浓度为0.4μg/ml。
(20) 二抗GAM：Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody，美国KPL公司（货号 04-18-06），Affinity purified polyclonal antibody to Mouse IgG, with both heavy and light chains (whole IgG)。Anti-Mouse IgG (H+L)二抗GAM是经过小鼠蛋白免疫过后的山羊的免疫球蛋白，它可以识别小鼠的免疫球蛋白IgG。本实验所用二抗的原始浓度为4×10-3μg/ml。
(21) c-myc蛋白： MYC Recombinant Protein(P01)，台湾Abnova Coporation公司 (货号：0980326)，0.64μg/mL。C-myc是一种原癌基因，在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及细胞周期的进程中起重要作用。
2.1.3 溶液配制
（1） pH=5.59的0.05mol/LPBS缓冲溶液：称取0.035g Na2HPO4，0.646g KH2PO4在小烧杯中溶解后，于容量瓶中用蒸馏水稀释到100ml；
（2） pH=7.0的0.01mol/LPBS缓冲溶液： 称取0.85gNaCl，0.22g Na2HPO4，0.05g NaH2PO4在小烧杯中溶解后，于容量瓶中用蒸馏水稀释到100ml；
（3）Piranha液：在通风橱内进行，按浓H2SO4（98%）∶H2O2（30%）＝3∶1的比例，用滴管将双氧水溶液非常缓慢地滴入浓硫酸中，顺序不能颠倒。该过程剧烈放热，可使用冷水浴；
（4）0.01mol/L L-半胱氨酸（L-cys）：称取0.0605g L-cys，溶于50mL蒸馏水，混合均匀，置于冰箱中备用；
（5）王水 ：浓硝酸和浓盐酸（1：3）混合；
（6）1%柠檬酸三钠：用电子天平称1g，用蒸馏水稀释到100mL； （7）2.5%戊二醛：25%稀释10倍，25%的戊二醛和蒸馏水（1：9）混合； （8）5%乙二胺：99%稀释到5%，由于乙二胺挥发性强所以要现用现配，取1mL和17mL蒸馏水混合；
（9）1m mol/L巯基乙醇：称取300m mol/L巯基乙醇100μL用30ml（3：1）的乙醇超纯水稀释即可；
（10）0.005mol/L NaCl：称取0.029g NaCl在烧杯中溶解后，于容量瓶中用蒸馏水稀释100ml；
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（11）0.1mol/L K2CO3：称取0.69g K2CO3在烧杯中溶解后，于容量瓶中用蒸馏水稀释50ml；
（12）1%聚乙二醇（PEG）：称取0.5g PEG在烧杯中溶解后，于容量瓶中用蒸馏水稀释50ml；
（13）0.02% NaN3: 取0.01g NaN3溶于烧杯中，在50ml的容量瓶中定容。为了使氮化钠溶液的含碱量在0.05%～0.06%范围内，从而保证反应时的pH值在6～8之间，在配制氮化钠溶液时应加入适量的10%氢氧化钠溶液；
（14）PH=7.2的 0.01mol/L PBS缓冲溶液：称取0.8g NaCl、0.02g KCl、0.144g Na2HPO4和0.024g KH2PO4,溶于80ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至100mL即可。保存存于室温或4℃冰箱中。
2.2 实验过程
2.2.1 纳米金的制备
先将1mL 1%的氯金酸加入99 mL超纯水中，煮沸，用超声波超声10 min，迅速加
入3mL 1%的柠檬酸钠，继续沸腾1h后停止加热，然后持续搅拌40分钟，当溶液的颜色从紫色变成蓝色最终变成红色时，表明纳米金已经合成成功。溶液一直搅拌，冷却至室温。冷却后溶液置于棕色瓶中保存在4 °C冰箱里待用。
2.2.2 L-半胱氨酸的固定
（1）清洗晶振
自制Piranha溶液后，用镊子夹住石英晶振引脚，将Piranha溶液小心地滴在金电极表面，缓慢转动手腕，使溶液均匀润湿石英晶体表面，静置2分钟后，用蒸馏水反复冲洗掉表面溶液，再用相同的方法清洗另一面，清洗后的石英晶振放置于通风处，自然干燥待用。清洗时注意防止强氧化性的Piranha溶液腐蚀石英晶振的其他部分。
（2）裸金电极测试
将金电极清洗并晾干后，置于检测室中用干燥的氮气冲洗3-5分钟，使气室中充满氮气，待频率稳定后，记录频率f0，并在电化学工作站上用循环伏安法测定其循环伏安曲线（0.01MPBS为缓冲溶液），保存原始数据。
（3）与L-半胱氨酸反应
将石英晶振置于0.01mol/L L-半胱氨酸（L-cys）中避光反应2h，然后晶振用pH=7.0的0.01mol/LPBS缓冲溶液冲洗，以优化半胱氨酸自组装层。
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2.2.3 戊二醛共价交联法抗体包被
将自组装了半胱氨酸的石英晶振置于2.5%的戊二醛溶液中活化1h，水洗、干燥。滴加20uL抗体c-myc于石英晶体电极表面，置于冰箱中12h。
2.2.4 c-myc蛋白的固定
滴加20uL蛋白c-myc于石英晶体电极表面，置于冰箱中6h。用水洗涤后，再滴加5%乙二胺、1mmol/L的巯基乙醇于石英晶体电极表面封闭非特异性结合位点，置于冰箱中30min。
2.2.5合成纳米金标记的二抗
在1ml的浓缩纳米金悬浮液中加入100μl 4.0×10-3μg/ml的GAM，搅拌1h，然后加入100μl10 mg/ml的BSA封闭非特异性结合位点，搅拌至少一个小时后，将所得溶液在8000rmp转速下离心15min，去除上层清液，沉淀重新溶解在10ml的PBS，所得纳米金标记的GAM溶液放置在冰箱中4℃条件下储存。
纳米金浓缩：取4根1.5 ml的离心管，每根离心管中放1ml的纳米金，对称放入离心机中设置好参数（10 min，4℃，8000 rmp），离心，完成后取下层油液100μl留下，4管合一管。
2.2.6 二抗的固定
滴加20uL纳米金标记的GAM于石英晶体电极表面， 置于冰箱中12h。
2.2.7 传感器的再生
将石英晶体于0.5mol/LNaCl+0.01mol/LNaOH溶液中洗涤10min, 再用水洗涤干燥后测频率变化。
2.2.8 晶振修饰前后的表征
将石英晶振取出，用蒸馏水反复清洗，待干燥后放入检测室中，用干燥的氮气冲洗3-5分钟，使气室中充满氮气，待频率稳定后，记录频率f1；在电化学工作站上用循环伏安法测定其循环伏安曲线，具体设置及测试方法如下：
① 三电极系统：自组装的金电极为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极；
② 使用前先检查仪器各个连接是否正常，然后开机；
③ 使用前先在Setup的菜单中执行硬件测试，系统便会自动进行硬件测试； ④ 测试正常后，5~10mL PH=7.4 PBS溶液于小瓶中，取出金电极、铂丝电极、Ag/AgCl电极即得三电极系统，分别与绿色夹头、红色夹头和白色夹头按要求连接，注
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意检查连接线路，不要短路。设定实验技术为循环伏安法，并选择参数如表2-1，开始实验，记录CV曲线，在测试过程中注意调节灵敏度得到较好看的图，进行数据处理、保存。
⑤ 关闭控制程序，然后关闭工作站电源。
表2-1 电化学工作站参数选择
InitE（V）= -0.2 Low E（V）= -0.2 InitP/N=P Segment=2 Quiet Time(s)=2 High E（V）= 0.6 Final E（V）=0 Scan Rate(V/s)=0.1~0.5 Smpl Interval (V)=0.001 Sensitivity(A/V)=5
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3 结果与讨论
3.1 L-半胱氨酸的固定
石英晶振与0.01mol/L的L-半胱氨酸反应后，使用循环伏安法和QCM进行表征，循环伏安法中以pH=7.4的0.01mol/L PBS溶液为底液进行扫描，结果如图3-1所示，曲线表明经L-半胱氨酸修饰后出峰位置移动，表明L-半胱氨酸成功固定；QCM结果：修饰前裸金频率f0=7990000Hz，修饰后f1=7988970Hz，△f=1030Hz，两种表征方法相互映证，L-半胱氨酸已被固定在金电极表面。
L-半胱氨酸固定前后频率变化范围：取多个石英晶振依次编号，用Piranha溶液洗涤，
水洗干燥后测基频f0。置入0.01mol/L L-半胱氨酸（L-cys）中避光反应2h，然后晶振用PBS冲洗干燥后测频率f。L-半胱氨酸固定前后频率的变化情况如图3-2所示，曲线表明L-半胱氨酸固定前后频率的大致变化范围为800Hz-1800Hz。
裸金4L-cysFrequency change of L-cys/Hz0.70.60.50.40.30.20.10.0-0.1-0.2330030002700240021001800150012009006000246810122Current/1e-5A0-2-4Potential/V (vs Ag/AgCl)Crystal number
图3-1 L-半胱氨酸修饰前后 图3-2 L-半胱氨酸固定的频率变化范围
3.2 戊二醛修饰电极
戊二醛与0.01mol/L的L-半胱氨酸反应后，使用循环伏安法和QCM进行表征，循环伏安法中以pH=7.4的0.01mol/L PBS溶液为底液进行扫描，结果如图3-3所示，曲线表明经戊二醛修饰后出峰位置移动，表明戊二醛成功修饰；QCM结果：修饰前频率f0=7988970Hz，修饰后f1=7987815Hz，△f=1155Hz，两种表征方法相互映证，戊二醛修饰成功。
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