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胆红素含量测定---方法专属性确认结果
测试样品 胆红素峰保留时间 胆红素对照品 7.183min 成品 7.170min 样品提取溶剂 在胆红素峰保留时间处为平直基线，无色谱峰。 人工牛黄阴性样品 在胆红素峰保留时间处为平直基线，无色谱峰。 项目确认结果: □通过 □不通过 检查人/日期： 复核人/日期
7.11胆红素含量测定方法线性关系与线性范围确认
7.11.1胆红素含量测定方法的线性关系与线性范围确认方法：
参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下规定，分别制备以下溶液，进行线性关系与线性范围的确认：
（1）胆红素对照品贮备液：取胆红素对照品10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，摇匀即得。
（2）线性关系测试溶液：分别精密量取胆红素对照品贮备液1.0ml、1.5ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml置50ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀得系列浓度的测试溶液。
试验方法：取上述每种浓度的线性关系测试溶液连续进样2针，测定胆红素峰面积平均值。液相色谱仪：LC-10AT，色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为甲醇-氯仿-1%磷酸溶液（81:13:6），检测波长449nm，每次进样量为20μl。
计算出各个测试溶液的胆红素浓度，以浓度为横坐标，胆红素峰面积平均值为纵坐标，计算线性回归方程、回归系数R、线性范围。
7.11.2方法确认接受标准：（1）测试溶液的胆红素浓度与峰面积之间呈良好线性关系，回归系数R：0.995≤R≤1；
（2）胆红素浓度线性范围：应涵盖人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下对照品溶液胆红素浓度4μg/ml（进样量20μl）的80%～120%，即结果的线性范围应涵盖3.2μg/ml～4.8μg/ml。 7.11.3方法确认记录与确认结果
（1）电子天平 型号 ，编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）胆红素对照品称样量9.90 mg 含量： 98.5% （3）项目确认结果
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胆红素含量测定方法--线性关系与线性范围确认结果
对照品浓度（ug/ml） 胆红素峰面积 胆红素峰面积均值 线性回归方程 回归系数R 21.9503 253200 253705 253453 2.9255 392493 388857 390675 3.9006 535260 531376 533318 Y=144980X-32906 5.8509 806465 802535 804500 7.8012 1106759 1103640 1105200 0.9996 线性范围 胆红素浓度 1.9503ug/ml～7.8012 ug/ml （进样量为20μl） 项目确认结果: □通过 □不通过
检查人/日期： 复核人/日期 7.12胆红素含量测定方法准确度确认（回收率试验） 7.12.1胆红素含量测定方法的准确度确认方法：
参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下规定，进行方法准确度的确认：
（1）胆红素对照品贮备溶液：取胆红素对照品10mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，摇匀即得。
（2）胆红素对照品溶液：精密取胆红素对照品贮备溶液1.0ml置25ml棕色量瓶中, 加氯仿稀释至刻度，摇匀制成每1ml中含胆红素约4μg的溶液，即得。
（3）回收率测试溶液：取20151201批人工牛黄甲硝唑胶囊（按照7.13项下方法测得其胆红
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素平均含量为0.0124%）的内容物，研细，充分混合均匀，精密称取适量（约相当于胆红素0.1mg），置50ml棕色量瓶中，精密加入胆红素对照品贮备溶液1.0ml，加氯仿-甲醇-水-盐酸(90：10：0.3：0.03)混合液约40ml，超声提取15分钟，取出，迅速冷却至室温，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得回收率试验溶液。
(4)精密吸取对照品溶液、回收率试验溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图及胆红素峰面积，按外标法计算回收率测试溶液中胆红素的量。 7.12.2方法确认接受标准：
At×Ws （1）计算公式：回收率测试溶液中胆红素总量(mg)=————— As×50
式中：At为回收率测试溶液的峰面积；
As为对照品溶液的峰面积； Ws为对照品称样量（mg）
测得胆红素总量-样品本底胆红素量
胆红素对照品回收率（%）=——----------------------------———×100% 回收率测试溶液中胆红素对照品加入量
（2）胆红素对照品回收率限度为94.0%～106.0%，回收率的相对标准偏差（RSD）限度为3.0% 7.12.3方法确认记录与确认结果
（1）电子天平 型号 编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）胆红素对照品称样量9.90 mg 含量： 98.5% （3）项目确认结果
胆红素含量测定方法-----方法准确度确认结果
试验编号 1 2 3 4 5 6 0.0124 0.9467 0.9280 0.9302 0.11739 0.11507 0.11534 0.09752 0.09752 0.09752 样品本底胆红素百分含量% 样品称样品本样量 底胆红（g） 素量（mg） 0.9418 0.9314 0.9527 0.11678 0.11549 0.11813 对照品加入量mg 0.09752 0.09752 0.09752 试验溶液峰面积 对照品溶液峰面积 488116 489280 488116 489280 488116 489280 488116 489280 488116 489280 488116 489280 测得胆红素总量mg 0.21376 0.21541 0.22144 0.21393 0.21405 0.21245 测得对照品加入量 mg 0.09698 对照品回收率 % 99.4 平均回收率% RSD 537158 534125 541616 537902 555002 554775 536416 535747 538876 533834 534445 530255 0.09992 102.5 0.10331 105.9 101.3 2.6% 0.09654 99.0 0.09898 101.5 0.09711 99.6 项目确认结果: □通过 □不通过 检查人/日期： 复核人/日期 7.13胆红素含量测定方法精密度确认
7.13.1胆红素含量测定方法的精密度确认方法：
参照人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准WS-10001-(HD-0204)-2002【含量测定 胆红素】项下方法
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测定含量，进行方法精密度的确认：
（1）液相色谱系统重复性：取20151201批成品的同一份含量测定溶液,在液相色谱仪上连续6次进样测定峰面积；
（2）胆红素含量测定的重复性：取20151201批成品，由同一人分别称取6份样品，用LC-10AT液相色谱仪进行含量测定。
（4）胆红素含量测定的中间精密度：取20151201批成品，由甲实验人员称取6份样品，进行测定（即上述胆红素含量测定的重复性）；再由乙实验人员在不同的日期称取6份样品，用另一台液相色谱仪LC-20AD进行测定。
7.13.2方法确认接受标准：
At×Ws×Vt
（1）计算公式：胆红素的绝对百分含量%=———----——×100% As×Vs×Wt
式中：At、As分别为样品、对照品的峰面积；
Wt、Ws为分别为样品、对照品的称样量（mg）
Vt、Vs为分别为样品、对照品的稀释倍数
（2）液相色谱系统重复性：同一份样品溶液连续6次进样，峰面积相对标准偏差限度为2.0% （3）胆红素含量测定的重复性：结果的相对标准偏差限度为2.0% （4）胆红素含量测定的中间精密度：结果的相对标准偏差限度为4.0% 7.13.3方法确认记录与确认结果
（1）电子天平 型号 编号 ，高效液相色谱仪型号 编号 （2）液相色谱系统重复性：同一份含量测定溶液,连续6次进样测定峰面积；，结果如下： 测定次数 峰面积 1# 532540 2# 531838 3# 527900 4# 529822 5# 527145 6# 526771 RSD(%) 0.46% 确认结果: □通过 □不通过 检查人/日期： 复核人/日期
（3）胆红素含量测定的重复性：成品批号20151201，平均装量237.3mg/粒；液相色谱仪：LC-10AT，进样量20μl
胆红素含量测定的重复性：
测定次数 样品称样量Wt(g) 样品稀释倍数 样品峰面积 样品峰面积平均值 1# 1.7345 50 532540 531838 532189 2# 1.6890 50 522293 523387 522840 3# 1.6831 50 524638 522605 523622 4# 1.6753 50 522318 525242 523780 5# 1.6842 50 522604 517359 519982 6# 1.6978 50 527574 523622 525598 平均值 —— —— 含量RSD —— —— —— —— —— —— 页码：19/25
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对照品称样量Ws(mg) 对照品稀释倍数 对照品峰面积 百分含量 每粒含胆红素，mg/粒 9.90 2500 488116 489280 9.90 2500 488116 489280 9.90 2500 488116 489280 9.90 2500 488116 489280 9.90 2500 488116 489280 9.90 2500 488116 489280 —— —— —— —— —— —— 0.0122% 0.0124% 0.0124% 0.0125% 0.0123% 0.0124% 0.0124% 0.83% 0.0290 0.0294 0.0294 0.0297 0.0292 0.0294 0.0294 0.83% 确认结果: □通过 □不通过 检查人/日期： 复核人/日期
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