⑦通过70％和无水酒精，风干。
⑧风干后用二甲苯加盖玻片封存。如不保存可直接观察。
经此方法染色后，细胞核染成蓝色，细胞质呈红色。在高倍镜(油镜)下观察各种非精子有形成分的量，估计它们所占的比例。 四、实验报告
绘出你所观察到的各类畸形精子。
实验七 精子顶体染色观察
一、目的和要求
顶体在精子受精过程中起着重要的作用。因它能释放蛋白质分解酶消化卵丘细胞之间的粘合基质，使精子能够通过卵的被膜进行受精。由于顶体结构的畸形，可导致受精率降低或者不受精。精子老化或损伤，会引起顶体帽破坏。精液冷冻解冻也会损伤一些精子，重要的是要准确知道受伤精子百分数。优质奶牛精液冷冻前，约90％精子具有完整的顶体。冷冻后下降至60％～65％。研究表明，顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间的相关性更强。因而，检查精子顶体完整率很重要。
本实验二人一组，要求学生学会精液抹片染色技术及比较正常精子顶体和异常精子顶体形态，计算精子顶体完整率。 二、材料和仪器
（一）材料 精液
（二）器材 酒精棉球，擦镜纸，移液枪，玻璃滴管，小镊子，pH试纸，玻璃棒，烧杯，小搪瓷盘，染色缸，卫生纸，玻璃平皿，切片盒，血球计数器，显微镜，镊子
（三）药品 Na2HPO4·12H2O ，NaH2PO4·2H2O，生理盐水，甲醛，MgCO3 三、内容和步骤
（一）试剂的配制 1．磷酸盐缓冲液
Na2HPO4·12H2O 2.2 g NaH2PO4·2H2O 0.55 g
先用少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容至100 ml。配制后用pH试纸测pH值，应为7.0～7.2。
2．福尔马林磷酸盐固定液 ①Na2HPO4·12H2O 2.25g NaH2PO4·2H2O 0.55g
置于100 ml烧杯中，加入0.89％NaCl溶液约30 ml，使之溶解。 ②加入甲醛MgCO3饱和液8ml。
甲醛MgCO3饱和液配制方法：在500 ml福尔马林（40％甲醛）中加入8 g MgCO3。此饱和液必须在一周前配好。
③用0.89％NaCl溶液少许冲洗装过甲醛的量筒置于容量瓶中，并定容至100 ml。此液配好后，第二天即可用。一般在室温下保存，其pH 为7.0～7.2。
3．Giemsa原液
按1 g Giemsa原料：66 ml甘油：66ml甲醇的比例配制。将Giemsa染料置于研钵中，先加入少量温热（60℃）的甘油，充分研磨至无颗粒呈浆糊状。再将剩余甘油全部倒入，置56℃恒温箱中保温2小时。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一个月后才能使用。此原液放置时间越长越好，但使用前需经过滤。
4．Giemsa染液（必须在染色前配制）
按Giemsa原液 : 磷酸缓冲液 : 蒸馏水的比例为2 : 3 : 5的比例配制。例如，做40个片子，每个片子需用2 ml染液。因此需配80 ml新鲜染液则分别取Giemsa原液16 ml、磷酸缓冲液24 ml、蒸馏水40 ml混匀即可。
（二）顶体染色步骤
先准备洁净的载玻片。用洗涤灵擦洗，清水冲洗，再用蒸馏水漂洗以不挂水珠为净，烘干或晾干备用。
1．抹片 将需测定的样品摇匀，取1滴中层精液平滴于载玻片的右端，取一块盖玻片，呈35°角自精液滴的左面向右接触样品，样品精液即呈条状分布在载玻片和盖玻片接触的边缘之间。将上面的盖玻片贴着平置的载玻片表面，自右向左移动，带着精液均匀地涂抹在载玻片上。切忌直接将精液滴“推”过去，人为造成精子损伤。在制作的抹片背面右端用特种记号笔编号。每份精液样品需同时制作两个抹片。
2．风干 自然风干5~20 min。
3．固定 将风干的抹片平置于染色架上，用滴管吸取1 ml固定液滴于抹片上，并使固定液布满于整个抹片表面，静止固定15 min。
4．水洗 用玻片镊夹住抹片一端，将固定液弃去倒入染色缸或平皿内，在装有蒸馏水的烧杯中，上下左右摇晃涮洗，夹住松开镊子几次，取出抹片于磁盘边待干。
5．染色 将固定后的抹片平置于染色架上，用滴管吸取新配制Giemsa染液约2 ml，置于要染的玻片上方平行。自左至右挤出染液于抹片上，使染液均匀布满在抹片上，静止染色90 min。
6．水洗 用镊子夹住染片，将染片上的染液弃去倒入平皿内，再换装有自来水的烧杯中冲洗，冲洗方法同上。经数次涮洗，直至水洗液无色为止。洗的过程中，若水已变蓝，则可及时换清水。洗净后可立于磁盘边待干。
（三）精子顶体观察
将精液染片置于显微镜下，先用低倍镜找到精子，再换1 000倍下进行油镜观察。精子顶体呈紫色，包围精子头前部。
根据精子顶体完整和损伤与否，将精子顶体形态分为4种类型：
1．顶体完整型 精子头部外形正常，着色均匀，顶体完整，边缘整齐，可见微隆起的顶体嵴，赤道带清晰。
2．顶体膨胀型 顶体轻微膨胀，边缘不整齐，顶体嵴肿胀，核前细胞膜不明显或缺损。 3．顶体破损型 顶体破损，精子质膜严重膨胀破损，着色浅且不均匀，头前部边缘不整齐。
4．顶体全脱型 精子顶体全部脱落，精子核裸露。
根据以上4种类型分别统计，观察300个精子，并计算出精子顶体完整率。
精子顶体完整率＝顶体完整型精子数/精子总数×100％
要求2张抹片精子顶体完整率差异不超过15％，求二者平均值。
一般精子冷冻前顶体完整率较高，如我国绵羊约44％～45％。解冻后1小时为25％。牛精子顶体完整率比羊高，猪比羊低。 四、实验报告
1．分析制片染色的质量。
2．观察并画出各种类型精子顶体形态。
3．计算精子顶体完整率。
实验八 稀释液配制及精液稀释
一、目的和要求
掌握稀释液配制的基本程序和操作方法及稀释精液的方法。 二、材料和器械
（一）材料 鸡蛋、原精液
（二）器材 250ml三角瓶，250ml烧杯，100ml量筒，感量为0.1克的天平，玻璃漏斗，电炉，石棉网，玻璃棒，定性滤纸，消毒纸巾，硫酸纸，灭菌牛皮纸，橡皮筋，10 ml一次性注射器，1 ml注射器，5 ml注射器，75%酒精棉球
（三）药品 葡萄糖，柠檬酸钠，青霉素，链霉素 三、内容和步骤
（一）玻璃用品的清洗与消毒 将所有玻璃用品用洗涤剂洗净，用稀盐酸浸泡并用自来水冲洗干净后，用蒸馏水冲洗4遍，空干水分，用锡纸将瓶口包好，放入120℃干燥箱中干燥1 h，放凉备用。
（二）天平的标准 用两张圆形硫酸纸放在天平的左右托盘上，校准天平。 （三）称量药品 按配方需要的量准确称取药品，并放入大烧杯中。 （四）溶液配制
1．用量筒量取双蒸水100 ml，加入烧杯中，用磁力搅拌器或玻璃棒搅拌使其溶解。 2．用一层定性滤纸过滤溶液至三角瓶中。
3．在三角瓶上加牛皮纸盖并橡皮筋固定，放在盖有石棉网的电炉上加热至沸腾，迅速将其取下，放凉，制成基础液。基础液如果不马上使用可放入在2~5℃冰箱中备用，保存时间不易超过12 h。
4．新鲜鸡蛋用75%的酒精棉球消毒外壳，待其完全挥发后，将鸡蛋磕开，分离蛋清、蛋黄和系带，将蛋黄盛于鸡蛋壳小头的半个蛋壳内，并小心地将蛋黄倒在用4层对折（8层）的消毒纸巾上。小心地使蛋黄在纸巾上滚动，使其表面的稀蛋清被纸巾吸附。先用针头小心将卵黄膜挑一个小口，再用去掉针头的10 ml的一次性注射器，从小口慢慢吸取卵黄，尽量
避免将气泡吸入，同时应避免吸入卵黄膜。吸取10 ml后，再用同样的方法吸取另一个鸡蛋的卵黄。也可将卵黄移至纸巾的边缘，用针头挑一个小口，将卵黄液缓缓倒入量筒中，注意避免将卵黄膜倒入量筒中。
5．卵黄液与基础液的混合 取80 ml放凉的基础液，加入三角瓶中，然后将卵黄液注入或将卵黄液从量筒中倒入三角瓶中，将量取的80 ml基础液反复冲洗量筒中的卵黄，使其全部溶解入基础液中，然后将全部的基础液倒入三角瓶中摇匀。
6．加入抗生素 分别用1 ml注射器吸取基础液1 ml，分别注入80万单位和100万单位的青霉素和链霉素瓶中，使其彻底溶解。分别从青霉素瓶中吸取0.1～0.12 ml和链霉素瓶中吸取0. 1ml，将其注入三角瓶中并摇匀。还可称取0.1克的青霉素和0.1克的链霉素加入三角瓶中摇匀。用基础液、卵黄液和抗生素混合制成第一液。
7．第二液的制作 用量筒量取第一液47 ml，加入另一只三角瓶中，用注射器吸取3 ml消毒甘油，注入三角瓶中摇匀，制成羊冷冻精液的第二液。
表1 羊精液稀释液推荐配方
低温（2~5℃）保存液
3.3 g 葡萄糖（一水）
1.4 g 柠檬酸钠（二水）
100 ml 双蒸馏水
80 ml 基础液
20 ml 卵黄
第一液
甘油
表2 牛精液细管冷冻精液稀释液推荐配方
73 ml 20 ml 7ml
10万单位 10万单位
基础液 低温保存或第一液 第二液
冷冻保存液 8.8 g ~ 100 ml 80 ml 20 ml 47 ml 3 ml
11%乳糖或12%蔗糖 卵黄 甘油 青霉素 链霉素
四、实验报告
简述基础液、低温保存稀释液、冷冻保存稀释液的制作方法。
实验九 家畜精液的冷冻
一、目的和要求