由第1次流动相梯度洗脱及流动相组成优化结果的图3可知，增加流动相的酸度和变更流动相梯度，取得了预期的结果，原全程梯度洗脱色谱保留时间45 min到50 min之间的色谱峰得到了较好的分离。根据图3的分离结果中，保留时间35min后，色谱峰较少、出峰时间较长，并且48 min后基线的漂移加大，调整流动相洗脱梯度为：0 min，45%A-55%B； 10 min， 55%A-45%B； 15 min， 55%A-45%B； 35 min， 75%A-25%B；36 min， 80%A-20%B； 56 min， 100%A-0%B； 保持至60 min。结果见图4。
由第2次流动相梯度洗脱优化结果的图4可知，变更流动相梯度，原48 min后基线的快速漂移得到了纠正，但原全程梯度洗脱色谱保留时间45 min到50 min之间的色谱峰得到了较好的分离，但保留时间35 min后出峰时间仍较长，为此对流动相的酸度进行了改变，由原来的1‰磷酸水溶液提高到2‰的磷酸水溶液，结果见图5。
图5 流动相优化3色谱图 图6 流动相优化4色谱图
由图4和图5对照分析得到，增加流动相的酸度，35min后出峰时间得到了一定程度的缩短，但保留时间35min后，色谱峰的出峰时间仍较长；同时，在色谱保留时间10 min前无明显的色谱峰，为缩短指纹图谱的时间，对流动相的洗脱梯度进行了进步优化，改变后的梯度条件为：0 min， 50%A-50%B； 5 min， 55%A-45%B， 10 min， 55%A-45%B； 30 min， 75%A-25%B；35 min，100%A-0%B；保持至45 min，此次优化结果见图6。
由图6可知，在优化后的流动相梯度条件下，各色谱峰的分离效果仍保持较好，但色谱保留时间有较大程度的缩短，达到了原定的目标。故初步确定该色谱流动相及流动相洗脱条件为色谱指纹图谱的实验条件。
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按上述的确定的流动相及流动相洗脱条件，对来源确定的温莪术挥发油样品(06-1)进行了色谱分离，同时根据先前的试验结果，对进样的样品浓度及进样量进行了调整，以获得好的准确度。改变后的状况为：取温莪术挥发油10 μl置于10 ml量瓶中，加入甲醇适量溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，经微孔滤膜过滤后，进样20 μl。指纹图谱的结果见图7。
图7 流动相优化5色谱图 图8 流动相优化6色谱图
由图7发现，温莪术挥发油在初定的流动相梯度条件下，35 min后分离结果极不理想，并且标准莪术油与温莪术挥发油的色谱指纹特征明显不同。经与相同条件下的广西莪术挥发油及蓬莪术挥发油的色谱指纹图谱比较，得到标准莪术油为广西莪术挥发油而不是温莪术挥发油。基于建立温莪术挥发油的指纹图谱的目的，对初定的流动相梯度条件进行了如下的变更：0 min， 55%A-45%B；5 min， 55%A-45%B； 25 min， 75%A-25%B； 40 min，75%A-25%B； 50 min， 100%A-0%B， 保持至60 min。变更后得到的结果见图8。由图8可知，在设定的流动相组成和梯度洗脱条件下，温莪术挥发油有较理想的指纹特征，并且色谱分离也较理想。因此，最终确定该色谱条件为挥发油的指纹图谱的色谱条件。
3.4 共有指纹峰的标定
3.4.1参照物色谱峰
按经优化最终确定了色谱条件对牻牛儿酮对照品与莪术醇对照品进行色谱洗脱，得到的对照品色谱色谱图见图9。由图9可知，牻牛儿酮对照品与莪术醇对照品分别在保
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留时间34.82 min和保留时间是17.13 min。基于温莪术挥发油的色谱图8中，莪术醇的色谱峰峰强度很小，而牻牛儿酮峰的峰强度相对较大，故选取牻牛儿酮峰为参照物色谱峰。
图9 牻牛儿酮对照品a与莪术醇对照品b色谱图
3.4.2色谱峰标定
根据温莪术挥发油的色谱图8，选取参照物色谱峰峰面积10%以上的色谱峰为温莪术指纹图谱的特征峰，并进行标记。其中，5号峰与7号峰为重叠峰。
3.5 方法学考察结果
按实验方法对温莪术挥发油指纹图谱方法学中的色谱精密度和稳定性的结果分别为表4、表5，表6和表7。精密度试验结果表明，5次重复进样温莪术挥发油的各特征峰的相对保留时间的RSD＜3%，色谱峰面积的RSD＜3%，达到中药色谱指纹图谱的要求。色谱稳定性试验结果表明，5批同一样品温莪术挥发油的各特征峰的相对保留时间
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的RSD＜3%，色谱峰面积的RSD＜3%，可满足中药色谱指纹图谱的要求。
表4 相对保留时间Rt精密度实验结果
共有峰 No
相对保留时间Rt
1 2 3 4 5 RSD﹪
1 0.497 0.496 0.500 0.499 0.495 0.43﹪ 2 0.553 0.554 0.555 0.555 0.550 0.37﹪ 3 0.646 0.646 0.631 0.647 0.645 1.45﹪ 4 0.798 0.800 0.800 0.800 0.797 0.18﹪ 5(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
6 1.573 1.568 1.567 1.582 1.588 0.58﹪ 7 2.188 2.194 2.193 2.185 2.185 0.19﹪
表5 峰面积比值精密度实验结果
共有峰 No
峰面积比值
1 2 3 4 5 RSD﹪
1 1.117 1.104 1.117 1.105 1.117 1.56﹪ 2 0.746 0.717 0.791 0.765 0.721 2.51﹪ 3 0.288 0.284 0.279 0.269 0.281 3.00﹪ 4 0.164 0.146 0.162 0.159 0.159 1.23﹪ 5(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
6 2.058 2.047 2.056 2.061 2.052 1.58﹪ 7 0.164 0.165 0.154 0.169 0.170 2.32﹪
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表6 相对保留时间Rt重现性实验结果
共有峰 No
相对保留时间
1 2 3 4 5 RSD﹪
1 0.495 0.498 0.499 0.500 0.501 0.46% 2 0.550 0.553 0.555 0.556 0.556 0.46% 3 0.645 0.647 0.646 0.647 0.647 0.13% 4 0.797 0.799 0.800 0.801 0.802 0.26% 5(s) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 6 1.588 1.568 1.565 1.560 1.563 0.70% 7 2.185 2.192 2.196 2.197 2.198 0.24%
表7 峰面积比值重现性实验结果
共有峰 No
峰面积比值
1 2 3 4 5 RSD﹪
1 0.131 0.131 0.128 0.132 0.132 1.89﹪ 2 0.816 0.820 0.826 0.834 0.834 0.98% 3 0.123 0.128 0.128 0.128 0.127 1.70% 4 0.178 0.179 0.179 0.181 0.179 1.56﹪ 5(s) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
6 0.952 0.965 0.955 0.953 0.949 0.63% 7 0.189 0.188 0.193 0.189 0.194 1.63%
3.6共有模式
3.6. 1共有模式的建立
对9批温莪术挥发油样品（06-2～06-10）的指纹图谱数据，经色谱保留时间的多峰校正和数据压缩，按2.6.3中的式（1）和式（2）计算全部指纹图信息的均值和中位数，建立相应的共有模式，结果如图10。各批样品与共有模式的相关系数与相和系数结果见
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