表8。由表8据看出9批温莪术挥发油指纹图谱与它们的共有模式间的相关系数和夹角余弦值相近、均在0.96以上满足中药色谱指纹图谱的质控技术要求。
图10 9批样品均值法a和中位数法b共有模式图
表8 9批样品相关系数与夹角余弦值
No
相关系数
夹角余弦 中位数 均值
中位数 均值
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0.9610 0.9677 0.9642 0.9703 0.9824 0.9798 0.9837 0.9812 0.9967 0.9959 0.9970 0.9961 0.9971 0.9969 0.9971 0.9967 0.9976 0.9964 0.9978 0.9967 0.9946 0.9956 0.9847 0.9958 0.9967 0.9971 0.9969 0.9972 0.9927 0.9952 0.9915 0.9941 0.9922 0.9936 0.9923 0.9937
3.6.2共有模式的检验
温莪术（06-1）样品及桂郁金与已建的共有模式比较，计算所得的数据见表9。表9
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表明验证样品温莪术与共有模式的相关系数的夹角余弦值在0.9以上，而桂郁金的相关系数的夹角余弦值不超过0.32。由此可见用9批温莪术建立的共有模式有较好的适用性，可用于温莪术质量控制和与桂郁金的区分。
表9 检验样本与共有模式的9相关系数与夹角余弦值
样品
相关系数
夹角余弦 中位数 均值
中位数 均值
温莪术 0.9610 0.9677 0.9642 0.9703 桂郁金 0.2049 0.1941 0.3150 0.3035
3.7挥发油色谱比较
按挥发油测定的色谱条件,分别测得的桂郁金与温莪术挥发油的指纹图谱,结果见图11。可明显发现它们的化学指纹图谱相差较大，它们的色谱峰的位及峰的数目有显著的差异。从温莪术指纹图(a)中至少可见到10个色谱峰， 桂郁金指纹图(b)中至少约12个峰, a图的7号峰峰面积很大相对较强，而在图b中没有该峰；图b中的5、8、9号峰为桂郁金的特有峰； 桂郁金与温莪术色谱中均有牻牛儿酮峰即6号峰，且峰面积均大。
图11 温莪术a与桂郁金b色谱指纹图
3.8姜黄素部分测定条件
3.8 .1 测定波长
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按起始流动相配比为10%乙腈-90%乙酸(4‰)、流速1 ml/min每min变化1%浓度、对姜黄的姜黄素部分供试液进行梯度洗脱90min。记录350 nm～550 nm色谱光谱，结果见图12。由所得的三维色谱光谱图可知，分离出的三种物质在420 nm有最大吸收，结合文献[24,25]初步判定三种物质分别为姜黄素、二氢姜黄素和去甲姜黄素，根据在线光谱可知，在520 nm以后无任何吸收。为进步确定测定波长，取姜黄素适量用甲醇配制成20 μg/ml的姜黄素对照品溶液，在仪器上测定其光谱，结果见图13。由图13可知姜黄素在420 nm波长附近有的最大吸收，故选择420 nm为测定波长，550 nm为参比波长，根据高效液相色谱仪的特点，初步选择相应的谱带宽分别为16 nm和100 nm。
图12 姜黄全程梯度洗脱色谱光谱图 图13 姜黄素对照品光谱图
3.8.2 色谱条件优化
4‰乙酸的浓度相当于0.7 mol/L，根据弱酸的pH值计算得pH为2.45。基于冰醋酸在紫外光区有一定的吸收，不利于色谱指纹图谱的相关研究，因此，将流动相的中的4‰冰醋酸改为相近的4‰的磷酸，按上述梯度条件进行洗脱，结果见图14。
比较4‰乙酸和4‰的磷酸流动相的洗脱结果可知，两者在出峰的数目上无差别，仅各峰的保留时间稍有不同，用4‰的磷酸作为流动相较用4‰乙酸出峰时间稍延后。由此初步确定所用流动相中的酸及其浓度为4‰的磷酸。并以桂莪术替代姜黄进行色谱条件进行测定的结果见图15。由图15得到，桂莪术的色谱指纹图谱较姜黄的色谱指纹图谱复杂的多，另由图15得知，桂莪术在保留时间60 min后无明显的色谱峰，此时相应的流动相中乙腈的浓度为70%，故将梯度条件改为：0 min，25%A-75%B；30 min，70%A-30%B；保持至45 min。第一次优化结果见图16。
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图14 乙酸A与磷酸B全程梯度洗脱色谱图 A－4‰乙酸作流动相 B－4‰磷酸作流动相
图15桂莪术全程梯度洗脱图 图16 第一次优化色谱图
从图16得知，桂莪术在保留时间15 min外有一明显的宽峰、分离欠佳，同时在保留时间40 min后无色谱峰，相对应的流动相中乙腈的浓度为65%。基于上述原因，进行第二次优化，变更色谱梯度洗脱条件改为：0 min，25%A-75%；保持5 min；45 min, 65%A-35%B，同时为了保护色谱柱，将B的酸度降至为2‰。第二次优化结果见图17。从图17得知，桂莪术色谱分离效果得到了改善。综合分析上述试验结果，最终确定了色谱条件为：0 min， 25%乙腈-75%磷酸(0.2%)水溶液；5 min，25%乙腈-75%磷酸(0.2%)
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水溶液；45 min，65%乙腈-35%磷酸(0.2%)水溶液。
按优化确定的色谱条件分别获取温莪术与桂郁金姜黄素部分的指纹色谱图18。比较温莪术与桂郁金姜黄素部分的指纹色谱图18-A与18-B可知，温莪术与桂郁金中的8、9、11号与13、14、15号的峰位相同，结合图14可知，这三对色谱峰分别为姜黄素、二氢姜黄素和去甲姜黄素；但温莪术色谱峰强度低于桂郁金。图18另能表明，温莪术中姜黄素部分的化学成分比桂郁金姜黄素部分的化学成分复杂的多。
图17 梯度洗脱第二次优化色谱图 图18 温莪术(A)与桂郁金(B)指纹特征
由于温莪术姜黄素部分色图谱形非常复杂，为证实是否由于未除的挥发油所至，
对除去挥发油，和未除油的图谱进行比较结果见图19,另对桂郁金的除去挥发油，和未除
油的图谱进行比较结果见图20。
图19温莪术的指纹特征 图20桂郁金的指纹特征
A－未除挥发油 B－除挥发油 A－未除挥发油 B－除挥发油
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