3 4 1 1 牛血清白蛋白残留量测定法 试验目的:测定牛血清白蛋白残留量
实验原理:1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
本法系采用酶联免疫法测定供试品中残余牛血清白蛋白(BSA)含量。
实验步骤：供 试 品 溶 液 的 制 备 供 试 品 如 为 冻 干 剂 型 ，检测前应按
标示量复溶后混勻，室温静置30分钟,检测前应再次混匀。 供试品如为液体剂型可直接用于检测。
干扰试验首次采用该法检测的供试品应进行干扰试验 。
制备溶液I(供试品倍比稀释）、溶 液 II (供 试 品 和 30ng/m l的内控标准品等量混合）和 溶 液 DI(30ng/ml的内控 标准品倍比稀释）。当供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定
范围中点时，则 2 倍 稀 释 后 制 备 溶 液 I 和 溶 液 II。 溶 液 I 、 溶 液 II 可倍比稀 释测定，溶 液 E 应 多 孔 测 定 （至 少 10 孔以 上 ），并在试验间均匀添加。按 测定法操作 ，分别测定溶液
I 、溶 液 n 、溶 液 in 的 b s a 含 量 ，溶 液 I 与 溶 液 n 的含量 之差应在溶液El含 量 测 定 值 的 95%可 信区 间内 ，表明供试 品不会对该检测法产生干扰作用。
测 定 法 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 ，并采用试剂盒提供的 供试品稀释液稀释供试品，供 试 品 应 至 少 进 行 2 个稀释度 测 定 ，每个稀释度做双孔平行测定。试剂盒标准品的吸光 度 、内控参考品测定值、标 准品 线性 相 关 系数 、双孔测定 吸光度均应在试剂盒要求范围内，试 验 有 效 。以标准品溶 液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，将供试品的吸光 度代入直线回归方程，再 乘 以 稀 释 倍 数 ，计算出供试品中 BSA含 量 。
【附注】 （1) 当同一供试品的低稀释度吸光度明显低于 高稀释度吸光度时，可 能 存 在 HOOK效应或操作失误，需 重试或调整稀释倍数进行检测。
(2)测 定 BSA含量的容器具应专用，防止实验室中BSA 污染。 ? 254 ? 歌渝公
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中国药典 2015 年版 3 4 1 3 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法 3 4 1 2 大肠杆菌菌体 蛋白质残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重 组制品中菌体蛋白质残留量。
试 剂 （1)包被液（PH9.6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠 0.32g、碳酸氢 钠0.58 6g,置 200ml量 瓶 中，加水溶解并稀 释至刻度。
(2)磷 酸 盐 缓 冲 液 （p H 7 .4 ) 称 取 氯 化 钠 8g、氯化钾 0.2g、磷 酸 氢 二 钠 1.44g、磷 酸 二 氢 钾 0.24g，加水溶解并 稀释至500ml, 121°C灭 菌 15分钟。
(3)洗涤液（pH7.4) 量 取 聚 山 梨 酯 20 0.5ml，加磷酸 盐缓冲液至500ml。
(4)稀释液（p H 7 .4 ) 称 取牛 血清 白 蛋 白 0.5g，加洗涤 液溶解并稀释至100ml。
(5)浓 稀 释 液 称 取 牛 血 清 白 蛋 白 l.O g, 加洗涤液溶解 并稀释至100ml。
(6)底物缓冲液（pH 5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液） 称取磷 酸氢二钠（Na2HP04 . 12H20)1. 84g、枸橼酸 0. 51g，加水 溶解并稀释至100ml。
(7)底 物 液 取 邻 苯 二 胺 8mg、30%过 氧 化 氢 30^1，溶 于底物缓冲液20m l中。临用时现配。 (8)终 止 液 lm o l/L 硫酸溶液。
标准品溶液的制备按菌体蛋白质标准品说明书加水复
溶，精密量取适量，用稀释液稀 释成 每lm l中含菌体蛋白质 500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng 的溶液。
供 试 品 溶 液 的 制 备 取 供 试 品 适 量 ，用稀释液稀释成每 l m l 中 约 含 2 50Hg 的 溶 液 。如 供 试 品 每 l m l 中 含 量小 于 500冲 时 ，用浓稀释液稀释1 倍 。
测定法取兔抗 大 肠杆 菌 菌体蛋 白 质抗 体适量 ，用包被 液溶解并稀释成每lm l中 含 10Mg 的溶液，以 100MI/ 孔加至 9 6 孔酶标板内， 4°C 放置过夜（16? 1 8 小时）。用洗涤液洗板 3 次 ；用洗涤液制 备 1%牛血清白蛋白溶液，以 200^1/ 孔加 至酶标板内，37°C放 置 2 小 时 ；将封闭好的酶标板用洗涤液 洗 板 3 次 ；以 100^x1/孔 加 人 标 准 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 ，每
个稀释度做双孔，同 时 加 入 2 孔 空 白 对 照 （稀 释 液 ）， 37°C 放 置 2 小 时 ；用稀 释液稀释辣根过氧化物酶（HRP) 标记的 兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体1000倍 ，以 100M1/ 孔加至酶
标板内，37°C放 置 1 小 时 ，用 洗 涤 液 洗 板 10次 ，以 lOOpl/ 孔加人底物液 ， 3 7 °C 避 光 放 置 4 0 分 钟 ，以 5 0 p l/ 孔加入
终
止液终止反应。用 酶 标 仪 在 波 长 4 9 2 n m 处 测 定 吸 光 度 ，应
用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作 图法计算。
以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以 供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量， 按以下公式计算： %
供试品菌体蛋白质残留量（％) = ^ ^ X 1 0 0 式 中 C为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng/ml; n 为供试品稀释倍数；
了为供试品蛋白质含量，mg/ml。
注 ：也可采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。 3 4 1 3 假单胞菌蔺体 蛋白质残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定假单胞菌表达系统生产的重 组制品菌体蛋白质残留量。
试 剂 （1)包被液（PH 9.6碳酸盐缓冲液） 精密称取碳
酸 钠 0.32g、碳 酸 氢 钠 0. 5 8 6 g ,置 200ml量瓶中，加水溶解 并稀释至刻度。
(2)磷 酸 盐 缓 冲 液 称 取 氣 化 钠 8.0g、氣 化 钾 0.20g、 磷 酸 氢 二 钠 1.44g、磷 酸 二 氢 钾 0 .2 4 g ,置 500ml量 瓶 中 ， 加水溶解并稀释至刻度，121°C灭 菌 15分钟。
(3)洗 涤 液 量 取 聚 山 梨 酯 20 0. 5ml，加磷酸盐缓冲液 稀 释 至 500ml。
(4)浓 稀 释 液 称 取 牛 血 清 白 蛋 白 l.O g，加洗涤液溶解 并 稀 释 至 100ml。
(5)稀 释 液 浓 稀 释 液 与 水 等 体 积 混 合 。
(6)底 物 缓 冲 液 （0. 005m ol/L醋酸钠-枸橼 酸缓 冲液 ） 称 取醋 酸 钠 0.68g、枸 橼酸 （C6H80 7 ? H2O )1 .0 5 g ,加水溶 解 并 稀 释 至 1000ml，调 p H 值 至 3. 6。
(7)底 物 液 A 称 取 3，3 '，5,5〔四 甲 基 联 苯 胺 （丁\\18) 0.08g，加 二 甲 基 亚 砜 40ml溶 解 ，加 甲 醇 60ml，混 匀 ，加 底 物 缓 冲 液 lOOml，避 光 搅 拌 2 小时至完全溶解，室温静置 4 小 时。
(8)底 物 液 B 量 取 1.5% 过 氧 化 氢 溶 液 3. 2ml，加底物 缓 冲 液 至 1000ml。
(9)底 物 液 临 用 前 取 底 物 液 A 、B 等体积混合。 (10)终 止 液 2m ol/L硫酸溶液。
标准品溶液的制备按试剂盒使用说明书用稀释液溶解
菌体蛋白质标准品，精密量取适量，用稀 释 液稀释成每lm l 中含菌体蛋白质 20ng、lOng、5ng、2. 5ng、1. 2ng、0. 6ng、 0. 3ng的溶液。
供 试 品 溶 液 的 制 备 取 供 试 品 适 量 ，用稀释液稀释成每 lm i中约含蛋白质100^^的溶液。如 供 试 品 每 lm l中含蛋白 质 量 小 于 200网 时 ， 用浓稀释液将供试品稀释1 倍 。 测 定 法 取 包 被 抗 体 ，用包被液稀释至适宜的浓度（稀 释倍数参 见试 剂盒 说明 书），以 10(^1/孔 加 至 9 6 孔酶标板 内 ，于 2?8 1 放 置 16?20小 时 ；用 洗 涤 液 洗 板 3 次 ；用洗 涤 液 制 备 1% 牛 血 清 白 蛋 白 溶 液 ，以 200^1/ 孔加至酶标板 内，置室温振荡（每 分 钟 200?300转 ）1 小 时 ，用洗涤液洗 ? 255 歌渝公
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3 4 1 4 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法
板 3 次；以10(^1/孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀 释度做双孔，同时加入2 孔空白对照（稀释液），置室温振荡