(每 分 钟 200?300转 ）1 小 时 ；用 洗 涤 液 洗 板 3 次 ；按试剂 盒说明书用稀释液稀释一抗至适宜的浓度，以 100F1/ 孔加至 酶标板内，置室温振荡（每 分 钟 200? 300转 ）1 小 时 ；用洗 涤液洗板3 次 ；然后按试剂盒说明书用稀释液稀释辣根过氧
化物酶（HRP)标 记 的 二 抗 至 适 宜 的 浓 度 ，以 100卩1/孔 加 至 酶标板内，置室温振荡（每 分 钟 200?300转 ）30分 钟 ，用洗 涤 液 洗板 8 次 ；以 100^x1/孔 加 人 底 物 液 ，置室温避光反应 10?15分钟，以 lOOpl/孔 加 人 终 止 液 终 止 反 应 。用酶标仪 在 波 长 450nm处 测定吸光度，应用计算机分析软件进行读 数和数据分析，也可使用手工作图法计算。
以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以 供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量， 按以下公式计算：
供试品菌体蛋白质残留量（％) = ^ ^ ?父100 式 中 c 为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng/ml; n 为供试品稀释倍数；
丁为供试品蛋白质含量，mg/ml。
注 ：也可采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。 3 4 1 4 酵母工程菌菌体 蛋白质残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定酵母表达系统生产的重组制 品菌体蛋白质残留量。
试 剂 （1)包被液（PH 9.6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠 0.32g、碳酸氢 钠0. 586g,加水溶解并稀释至200ml。 (2 )P B S 称 取 氣 化 钠 8.0g、氣 化 钾 0.20g、磷酸氢二
钠 1.44g、磷 酸 二 氢 钾 0 .2 4 g ,加 水 溶 解 并 稀 释 至 1000ml， 调 p H 值 至 7_ 4，1211C灭 菌 15分钟。
(3)洗涤液（PBS\量取聚山梨酯200. 5ml, 加 PBS 至 1000ml。
(4)稀 释 液 称 取 牛 血 清 白 蛋 白 0.5g，加洗涤液溶解并 稀 释 至 100ml。
(5)底物缓 冲液 （0. 005mol/L醋酸钠-枸橼 酸 缓 冲 液 ） 称取醋酸钠0.68g、枸橼酸 （C 6H 80 7 ? H 20)1.05g,加水溶 解并稀释至1000m l,调 p H 值 至 3_ 6。
(6)底 物 液 A 称 取 3,3、5 ,5 '-四 甲 基 联 苯 胺 （丁1^18) 0. 0 8 g ,加 二 甲 基 亚 砜 40ml溶 解 ，加 甲 醇 6 0 m l,混 匀 ，加
底物缓冲液100m l,避 光 搅 拌 2 小时至完全溶解，室温静置 4 小时。
(7)底 物 液 B 量 取 1.5%过 氧化 氢 溶 液 3.2ml，加底物 缓 冲 液 至 1000ml。 %
(8)底 物 液 临 用 前 取 底 物 液 A 、底 物 液 B 等体积混匀。 (9)终 止 液 lm o l/L 硫酸溶液。 中国药典 2015 年版
标准品溶液的制备 按试 剂盒使 用 说明书加水复溶，精
密 量 取 适 量 ，用 稀 释 液 稀 释 成 每 lm l中 含 菌 体 蛋 白 质 lOOOng、500ng、250ng、125ng、6,2. 5ng 的溶液。
供 试 品 溶 液 的 制 备 取 供 试 品 适 量 ，用稀释液稀释成适 当浓度。
测定 法取 豚 鼠抗 酵母 工程 菌 蛋 白质 抗体 适量，用包被 液稀释成适当浓度，以 100^1/孔加至酶标板内，用保鲜膜封 好 ，于 4°C放置过夜；用洗涤液洗板3 次 ，用洗涤液制备1% 牛血清白蛋白溶液，以 200^1/孔加至酶标板内，3 7 t 放 置 2 小 时 ；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3 次 ；以10(^1/ 孔加 入标准品溶液及供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加人
2 孔空白对照（稀释液），封 板 ，37°C放 置 1 小 时 ；用洗涤液 洗 板 6 次 ；按试剂盒使用说明书取兔抗酵母工程菌蛋白质抗
体适量，用稀释液稀释成适当浓度，以 100^1/ 孔加至酶标板
内 ，封 板 ，37°C放 置 1 小 时 ；用洗涤液洗板6 次 ；用稀释液 稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体溶液 （IgG~HRP) 至 适当浓度，以 100^1/孔加至酶标板内，用保鲜膜封好，37T：
放 置 1 小 时；用 洗 涤 液 洗 板 6 次 ，以 100y/孔 加人底物液， 室 温 避 光放 置 5? 10分 钟 ；以 10CV1/ 孔加入终止液终止反 应 。用酶 标仪 以630nm波长为参比波长，在 波 长 450nm处 测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也 可使用手工作图法计算。
以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以 供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量， 按以下公式计算：
供试品菌体蛋白质残留量 （％) = ^ ^ X 1 0 0 式 中 c 为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng/ml; n 为供试品稀释倍数；
了为供试品蛋白质含量，mg/ml。
注 ：也可采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定
酶联免疫吸附实验（ELISA）
BIOX.CN 2004-9-7 14:41:36来源：生命经纬 基本原理 方法类型和操作步骤
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
（六）应用亲和素和生物素的ELISA
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗
体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。