1. 引言
葡萄（Vitis vinifera L.）在植物学分类中属于葡萄科(Vitaceae Lindley 或 Ampelideae Kunih)葡萄属(Vitis L.)的藤本浆果。葡萄科中有12个属，约600个种[1]。葡萄是最古老的被子植物之一，起源于欧、亚大陆和北美洲的连片地区。主要栽培类型则起源于中亚西亚一带，主要分布于世界的温带、亚热带、热带地区，主要野生于森林、山坡或河谷等地。葡萄科中只有葡萄属有较高的经济价值，并且得到广泛的栽培和较深入的研究。葡萄是一种营养价值较高的浆果，素有水果皇后的美誉，广泛应用于我们的日常生活中，它不但营养丰富、用途广泛：色美、气香，味可口，是果中佳品，既可鲜食又可加工成各种产品，如葡萄酒、葡萄汁、葡萄干等，而且果实、根、叶皆可入药，全身都是宝。是国际市场上重要的商品[1]。
长期以来，葡萄栽培面积和产量一直居于世界各类水果前列。全世界葡萄栽培面积以欧洲为最多，占68.0%；其次是亚洲，占17%；再次是美洲和非洲分别占 9.7%和 4.4%；最少的是大洋洲，仅占 0.9%。栽培面积的国家和地区大多集中在欧洲。在世界葡萄总产量中，约 80%用于酿酒，13%用食，其余约 7%用于制干、制汁等[2]。近几年,我国的葡萄生产发展速度非常快,产量已居世界首位。然而,我国的葡萄生产与全世界相比，存在产量低、果实品质差和育种落后等问题。生产上应用的主要品种打多是从国外引进的, 总体而言，中国葡萄的质量低、售价廉、效益不高是普遍和主要的，因此难以在国际果品市场上形成强有力的竞争优势和自己的特色 [2-3]。从长远来看,选育适合我国种植的抗逆性强、品质好,果实粒重大的新品种，是提高经济效益使我国葡萄生产产业化进一步发展的出路所在。
葡萄在我们的现实生活中已经成为最重要的水果之一。在世界范围内，绝大多数食用和酿酒葡萄都来源于一种被称为欧洲葡萄的亚欧葡萄。尽管这个品种的葡萄已培育了6000个不同的栽培品种，但他们都来源于同一祖先，因此其遗传可变性非常有限。这种葡萄大部分栽培品种易感染细菌、病毒、真菌，对不良环境的耐受能力和抵抗较差。葡萄在自然条件下的生长过程中不可避免地遭受到各种逆境因子如：干旱、低温、病虫害等的侵袭。经研究表明，选育具有良好抗逆性的葡萄品种已经是解决问题的关键[3]。
植物启动子RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因（gene）
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的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像―开关‖，决定基因的活动。植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子(ATG)上游-40--70bp处，转录起始的保守序列为CTCATCA，中间的A为转录的起始点(编号为+1)[4]。启动子是确保基因转录精确而有效起始的一段DNA5’端的调控序列。启动子与RNA聚合酶Ⅱ以及其他反式作用因子的相互作用是基因表达的启动子调控模式的本质所在[5]。启动子决定着基因时空表达的特异性，目前通常采用分子生物学手段对生物反应器进行遗传改良，希望插入的外源目的基因能够限定在某一特定的组织或部位进行高效表达，在不影响该生物反应器其它特性的条件下，能集中在靶组织收集表达产物[6]。植物启动子由核心元件和上游元件构成,如TATA-box和起始因子(initiator)。在与逆境相关基因的启动子序列中还存在一些参与基因转录调控的与逆境诱导相关的顺式作用元件。由于信号测激雨具有转录活性的启动子称为诱导型启动子。该类启动子可以快速有效地诱导转录基因的―开、关‖：可根据需要在植物特定发育阶段、组织器宫或生长环境下接受诱导蕾号，诱导基因表达；也可以随时解除胁迫，停止表达[7]。
盐碱、干旱、极端温度(低温和高温)等是制约植物生产的主要逆境因子，逆境胁迫会使植物因缺少水分的供应而抑制植物的生长。解除盐碱、干旱、极端温度等对作物生产的约束，培育抗逆性高的作物品种，一直是各国科学家研究的焦点之一[8-15]。作物对极端环境的抵抗抗机理十分复杂，但现在科学研究对植物抗逆胁迫的机理认识还不够，利用传统的育种方法进行种内或种间得杂交等方法提高作物对逆境胁迫的抗性能力是有限的。随着植物分子遗传育种研究的发展，对与作物抗逆胁迫分子机理中与抗逆相关的位点进行分子标辅助育种[16]，并利用作物在抗逆胁迫中产生的与作物产量相关的膜稳定性、生理生化代谢、渗透调节其它的一些调控基因对作物的抗逆性进行基因工程改良分子育种取得重大进步[17-18]，但是由于作物对逆境的抵抗机制非常复杂，所以很难从整体上把全面掌握作物对逆境胁迫的抵抗机理，使得这些分子改良育种手段的利用未得到全面发挥。水稻、拟楠芥等基因组序列测序的完成，使科学家们进一步深入的认识到植物的基因组中仅有2％左右的基因序列编码mRNA从而翻译成蛋白质等生命物质，大部分的基因续写为内含子和重复序列[19]，因而对编码基因序列及其功能的研究成为热点，
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生命科学的研究进入了后基因组时代，即功能基因组时代。目前，对功能基因组的研究日益成熟，可以从整体上对作物的抗逆机理进行研究，为全面发挥分子标记辅助育种和转基因改良植物的抗逆性提供了新的理论基础和技术[20]。
2. CAN启动子的克隆 2.1 材料
将继代培养的葡萄幼苗用于总DNA的提取。
菌种和载体：大肠杆菌DH5α由本实验室提供，T-A载体购于TaKaRa公司。 酶及化学试剂：各种限制性内切酶SacⅠ、HindⅢ、均购于TaKaRa公司。其他所需药品均为分析纯。
2.2 方法
2.2.1 组培培养葡萄幼苗 1、 1/2MS生根培养基
1）根据培养基配方，分别加入下列溶液
混合液成分 大量元素(10×) 微量元素(100×) 铁盐(100×) 有机物(100×) CaCl2(50×) 2）加入蔗糖30g、肌醇0.1g。
3）加入IAA至终浓度为1mg/mL充分搅拌溶解后，定容至1L。 4）用1M NaOH或0.1M HCL调节pH值到5.8。 5）加入琼脂8g，煮沸溶解。
6）将培养基分装至20～23个培养瓶中封口。
7）将分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。
2、在超净工作台上把葡萄幼苗剪切带芽幼茎接到1/2MS生根培养基上进行培养，完成后放入恒温箱中保存，定期观察花生的生长情况，培养至幼茎生根发芽并发
加入体积（1L） 50 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 5
育成小苗，即进行试验。 2.2.2 葡萄基因组DNA提取：
1） 新鲜叶片在液氮冷冻下加石英砂迅速研磨成粉末。
2） 加入500μL 65℃预热的CTAB和1％β-巯基乙醇5μL，65℃水浴20min，间隔混匀。
3） 加入等体积的氯仿抽提（去除掉细胞内的蛋白质，如与DNA结合的组蛋白），缓摇10min，混匀，12000r/min离心5min。
4） 剪枪头，取上清至新离心管中，加等体积的（约400μl）异丙醇，缓摇5min，静置5min（异丙醇的作用是用来沉淀DNA），10000rpm离心5min，弃上清。 5） 加入500μL 75％乙醇洗涤，倒掉乙醇，快速离心吸收（共洗2次）。 6） 加入200μL含有RNase的TE重悬沉淀， 37℃（金属浴）放置，20-30min。 7） 200μL苯酚/氯仿/异戊醇，混匀抽提，12000rpm离心5min。重复两次。 8） 剪枪头，取上清，二合一至新管中。
9） 加1/40体积NaAc（约35μL）,2.5倍体积的无水乙酮（冰），约800μL混匀。 10） 12000rpm，离心5min。弃上清，75％冰乙醇洗涤，400-600μL，倒掉，快速离心吸干，静置7min。取适量的ddH2O溶解（50-100μL），取2μL电泳鉴定。 2.2.3 目的基因的PCR扩增 1 引物序列的设计
利用已知的基因序列找到其逆境胁迫诱导型启动子的序列并由此设计引物，设计的引物序列如下：
VVESTPF1： ACACTCGTCCCATCTCCCATC VVESTPR1： TCCAAGTCTTTCCTAGTTGCTC
2、以提取的葡萄基因组总DNA为模板，利用设计好的引物进行PCR扩增，以获得目的片段。 （1）反应体系
混合液成分 10×buffer(Mg2+) dNTP(2.5mM) 加入体积（25μl） 5μL 4μL 6
引物1 (20μM) 引物2 (20μM) LA Taq (5U/μl) DNA ddH2O Total (2) 反应程序：
0.5μL 0.5μL 0.25μL 6μL 11.25μL 25μL PCR扩增各个DNA片段的条件：扩增CAN启动子反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，57.3℃退火40秒，72℃延伸2分钟，30个循环后，72℃延伸10分钟,反应产物4℃保存。同时设置不加基因组DNA的空白对照。 3琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
1.0%的琼脂糖凝胶的制备：称取0.4g琼脂糖放在三角瓶中加入40mL TAE缓冲液，放入微波炉中加热至溶解，轻轻摇动几次，充分溶解，冷却至约55℃，加入4μL EB，摇动三角瓶，使加入的EB充分混匀，倒入准备好的制胶槽中，待其充分凝固。取6μL PCR产物加入1μL 6×loading buffer混合，点样于1%的琼脂糖凝胶中，同时点样 1kb Marker Labber，4μL，在电压100V条件下，电泳30min后在紫外检测仪上观察电泳结果，并拍照。 2.2.4 基因片段的回收
PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，切下目的基因片段用凝胶回收试剂盒进行回收纯化。使用OMEGA柱式回收试剂盒，操作步骤如下： 1、 1） 2） 3） 2、 1） 2） 3）
层析柱的平衡：
在层析柱中加入200μL buffer GPS，室温放置3-5min 将层析柱12000rpm，离心2min
在层析柱中加入加700μL水，12000rpm离心2min，放置待用。 试剂盒进行回收纯化
取两个灭菌的EP管称量并标记。
将切下的含有目的基因片段凝胶放入离心管中，再次称量。 按每增加1g加1mLBinding Buffer的量等量加入Binding Buffer。
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