小片段和一条大片段时，启动子是以正义连接到载体上，而若得到约602bp片段和另一条大片段时，说明是反义载体。结果表明，即得到了正义（1号）和反义（2号）两个载体。
2.3.5 克隆的启动子序列测定：
为了进一步验证所克隆的启动子片段的正确性，将正义连接的载体送到公司进行了序列测定。
Query 1 TATTTGTTAAACATTTTTTATTATGAGTGGAACATAACAAATTTAGGAGTTGAAACTTTT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1391 TATTTGTTAAACCTTTTTTATTATGAGTGGAACATAACAAATTTAGGAGTTGAAACTTTT 1332
Query 61 atttaaaGAGTGGTATAATTTTTAAAACAAAATCCGAAACTCGTCTTAATCTTGATTAAA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1331 ATTTAAAGAGTGGTATAATTTTTAAAACAAAATCCGAAACTCGTCTTAATCTTGATTAAA 1272
Query 121 AGGCaaaaataatttttaaataaaatttatttcattttatatataatctaataacataat 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||||||||| Sbjct 1271 AGGCAAAAATAATTTTTAAATAAAATTTATTTCATTTTATATACATTCTAATAACATAAT 1212
Query 181 tttatttttcccaagaatttgtatttatgaattacatattttatatGTTGAAAGGTGAAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1211 TTTATTTATCCCAAGAATTTGTATTTATGAATTACATATTTTATATGTTGGAAGGTGAAA 1152
Query 241 ACACTCGTCCCATCTCCCATCCTTCCatttatttactaatttttttaataattaaattta 300 |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1151 ACACTCGTCCCATCTCCCATCCTTCCATTTATTTACTAATTTTTTTAATAATTAAATTTA 1092
Query 301 AGTTCTTTGAAAGGAACTAGGAAGCTCAAGTGGCTCAGCGAACACATGAGCATAGAAAAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1091 AGTTCTTTGAAAGGGACTAGGAAGCTCAAGTGGCTCAACGAACACATGAGCATAGAAAAG 1033
Query 361 CGTTCTTACAACCTTGAACTCGATAATATCAGGCaaaaaatggaaattaattacaaaaat 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1032 CGTTCTTACAACCTTGAACTCGATAATATCAGGCAAAAAATGGAAATTAATTACAAAAAT 973
Query 421 aaattgaaatggaaaattcaaaGGTGTTTttattattattattattTTCTTTTCTTAAAA 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 972 AAATTGAAATGGAAAATTCAAAGGTGTTTTTATTATTATTATTATTTTCTTTTCTTAAAA 913
Query 481 TCTTGAGGGTATAGAATTGGTAAAAAGGTAAAATCGGGTTTGGCTGGTGGGTCGTGTATG 540 |||||||||||||| |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||
13
Sbjct 912 TCTTGAGGGTATAGAATTGGTAAAAAGGT-AAATCGGGTTTGGCTGGTGGGTCGTGTATG 853
Query 541 TCTCGGAGGAGACTGGCTAGTGGATGATACACAATTCATAATCTCTGACAGAGATAATGA 600 ||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 852 TCTTGGAGGAGACTGGCTAGTGGGTGATACACAATTCATCATCTCTGACAGAGATAATGA 793
Query 601 CAAGTCTTTTCTT--CTC-T---CTT-TC-GCTTATCACATTCAAAATTATCATCAATGA 652 ||||||||| ||| ||| | ||| || | |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 792 CAAGTCTTTGCTTCCCTCTTGCGCTTATCAG-TTATCACATTCAAAATTATCATCAATGA 734
Query 653 TACAACACCCCTTTTAACCACAAAAGTTAAAAATGAGAGGCCTATTGGCTATACATTTCA 712 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 733 TACAACACCCCTTTTAACCACAAAAGTTAAAAATGAGAGGCCTATTGGCTATACATTTCA 674
Query 713 AATTGTACCATCATCATCATGGGGTCGATATTAATGCAAATGGGAGGAGATTCCACATAA 772 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 673 AATTGTACCATCATCATCATGGGGTCGATATTAATGCAAATGGGAGGAGATTCCACATAA 614
Query 773 AAATTTGTATGAAATATGTGCattaaaattaattttaaaatacatactaaatttacaaaa 832 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 613 AAATTTGTATGAAATATGTGCATTAAAATTAATTTTAAAATACATACTAAATTTACAAAA 554
Query 833 ataatttgagaataattcaaaaattattttctaatattttgtaaaacaaatGCTAGtttg 892 |||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 553 ATAATTTGAGAATAATTCAAGAATTATTTTCTAATATTTTGTAAAACAAATGCTAGTTTG 494
Query 893 aaaatctaaaatatttttaccttattttttatatttttaaatatgttttaaaaataaatt 952 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 493 AAAATCTAAAATATTTTTACCTTATTTTTTATATTTTTAAATATGTTTTAAAAATAAATT 434
Query 953 ttatatgtagtattttagttttaattatttttcatatttatataattattttttaaaaca 1012 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 433 TTATATGTAGTATTTTAGTTTTAATTATTTTTCATATTTATATAATTATTTTTTAAAACA 374
Query 1013 atgttcaaaaaataaaacaagtcaaaataatttaaaaaaaattattttttaattattaaa 1072 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 373 ATGTTCAAAAAATAAAACAAGTCAAAATAATTAAAAAAAAATTATTTTTTAATTATTAAA 314
Query 1073 tatatatattttaaaattttattttaaaaaatgaaaaactgtttttgaaaaCACTCACCA 1132 ||||||| | | ||||| ||||| | |||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 313 TATATATGT---A---TTTTA----AAAAA-TCAAAAACCGTTTTTGAAAACACTCACCA 265
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Query 1133 GGAGTAGCATAGAAATTCAATTTACTATTACATTGGGTTTTGTAGACCCTTTGAGGGTTG 1192 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 264 GGAGTAGCATAGAAATTCAATTTAGTATTACATTGGGTTTTGTAGACCCTTTGAGGGTTG 205
Query 1193 AACAGGTAATATCCCCTAAAAAGAGAGAAGACAAACCAATATAATATTACAGCTATATGG 1252 |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 204 AACAGGTAATATCCCCTAAAAAGAGAGAAGACAAACCAATATAATATTACAGCTATATGG 145
Query 1253 AAGACTTGGAAATTTCCTAGAAAGTGGATTTGTAAatatatatatatata--CTAATACT 1310 ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 144 AAGACTTGGAAATTTCCTAGAAAGTGGATCTGTAAATATATATATATATATACTAATACT 85
Query 1311 ATATTTTGGTTTCTTAAATAAGGAGCAACTAGGAACCACATGAA 1354 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 84 ATATTTTGGTTTCTTAAATAAGGAGCAACTAGGAACCACATGAA 41
图3-6克隆的启动子序列与已知启动子序列的比对图
测序结果表明，所克隆的启动子片段的长度为1354 bp，其序列与基因bank公布的已知序列同源性极高，达到97%，表明已克隆到葡萄CAN基因的启动子。
3、 植物表达载体pBI1391Z- CAN的构建 3.1 试验材料
3.1.1 菌株与载体
农杆菌菌株EHA105、大肠杆菌菌株DH5α为本实验室保存；表达载体为pBIA1391Z质粒pMD19-T- CAN 3.1.2 酶和试剂
限制性内切酶EcoR I、Pst I、1Kb Marker、DL12000Marker、Rif、Kar；T4-DNA Ligase、PCR试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒DNA提取和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自OMEGA生物有限公司。
PCR引物由北京三博远志有限公司合成，宝生物工程（大连）有限公司完成
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测序；其它化学试剂均为国产分析纯。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。 3.1.3 仪器耗材
台式离心机、制冰机、微型旋涡混合仪、恒温摇床、超净工作台、电子天平、pH 计、微波炉、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、磁力加热搅拌器、电热恒温鼓风干燥箱、电泳仪、水平凝胶电泳槽、紫外分析仪、恒温金属浴、10mL、50mL离心管、移液枪（1000μL、200μL、20μL、2.5μL）等。
3.2 试验方法
3.2.1植物表达载体pBI1391Z- CAN的构建 （1）大肠杆菌质粒DNA的提取
1）在1.5mL离心管中加入1mL菌液，4℃，12000rpm离心1min，弃上清液。 2）加100μL预冷的溶液I，剧烈振荡后于室温下放置5min。 3）加200μL新配制的溶液II，温和地颠倒数次，放冰上3min。 4）加150μL冰上预冷的溶液III，温和地颠倒数次，冰上放置5min。 5）4℃，12000rpm离心10min，上清液转到新管中。
6）加入等体积冰预冷的苯酚氯仿异戊醇（25：24：1），振匀后于4℃，12000rpm离心5min，上清液转到新管中。重复一次。
7）加入2 倍体积无水乙醇，混匀后于4℃，12000rpm 离心5min，弃上清液。 8）加入1mL70%乙醇洗涤沉淀，离心5min，弃上清。 9）吹干后每管加20μLTE溶解。
（2）用限制性内切酶PstI和EcoRI分别双酶切质粒pBIA1391Z和质粒质粒pMD19-T- CAN酶切体系如下：15μL质粒，2.5μL 10×T buffer，5μL 1%BSA，两种内切酶各1μL，25.5μL ddH2O，总反应体积为50μL。30℃酶切3h，用1%琼脂糖凝胶电泳40min，用DNA 凝胶回收试剂盒纯化回收pBIA1391Z 的大片段，记为片段1，回收pMD19-T- CAN70200 的小片段，记为片段2。 （3）片段1和片段2的连接
连接体系如下：1μL片段1，2μL片段2，1μL 10×T4 DNA ligase buffer，1μL T4 DNAligase，5μL ddH2O。总反应体系为10μL，16℃连接4h。
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（4）将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞中，提取质粒酶切验证。 3.2.2. 植物表达载体pBI1391Z- CAN转入到农杆菌 （1）. 农杆菌（EHA105）感受态细胞的制备
1）挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养两天。 2）取2mL培养好的菌液接种于50mL液体LB培养基中，继续培养至0D值约0.5。 3）将活化好的菌液放在冰上30min，然后4℃，5000rpm，离心10min，弃上清。 4）加入10mL0.15mol/L NaCl悬浮菌体，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清。 5）加入1mL 20mmol/L冰冷的CaCl2悬浮，分装在EP管中200uL/管，加入等体积的甘油，置于液氮中速冻lmin，取出于-80℃保存 （2）冻融法转化农杆菌
1）将制备好的农杆菌EHA105感受态细胞放在冰上待其融化。
2）加入1ug表达载体pBI1391Z- CAN质粒DNA，冰浴30min，液氮中冷冻lmin，然后在37℃水浴锅中水浴5min。
3）加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，28℃、120rpm，振荡培养3h。 4）3000rpm离心1min浓缩菌液，用100uL LB重悬菌体。
5）将菌体涂布于含有50mg/L Kar和50mg/LRif的固体LB培养基，28℃培养2天。
3.3 结果与分析
3.3.1 表达载体pBI1391Z- CAN的构建
Marker 1
图 3.1表达载体pBI1391Z- CAN70200的酶切鉴定图
左侧为1kb Marker，右侧1号泳道为表达载体pBI1391Z- CAN的双酶切电泳图
1500bp 1000bp 10000bp
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