经琼脂糖凝胶电泳检测，如图3.1 所示。结果显示， pBI1391Z- CAN经EcoR?和Pst?双酶切后产生了约为1.4 kb和pBI1391Z约为11kb的两条条带。上述结果与预期结果相同。表明植物表达载体pBI1391Z- CAN构建完成。
4 农杆菌介导的烟草遗传转化及转基因植株分析 4.1 试验材料
4.1.1 供试烟草品种
烟草 4.1.2 菌株和载体
农杆菌菌株：根癌农杆菌菌株EHA105为本实验室保存。 构建好的载体pBI1391Z- CAN。 4.1.3 培养基
LB培养基：LB Medium（上海生工），液体（25g/L），固体（40g/L） pH7.0。 预培培养基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 共培培养基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 生根筛选培养基：1/2 MS+250 mg/L Car+ 10 mg/L Hyg
以上培养基均添加3%蔗糖，0.7%琼脂，pH值为5.8，121℃高温高压灭菌20min。
4.1.4 主要生化试剂及其配制 1．抗生素的配制
卡那霉素（Kna）、潮霉素（Hyg）、羧苄霉素（Carb）均购自生工生物有限公司，卡那霉素（Km）用无菌水配成50mg/mL的母液，潮霉素（Hyg）用无菌水配成10mg/mL的母液，头孢霉素（Cef）用无菌水配成100mg/mL的母液，三者均用0.22μm滤膜过滤灭菌后分装于无菌离心管，–20℃保存。
4.2 试验方法
4.2.1 农杆菌的活化及菌液制备
挑取含有pBI1391Z- CAN 载体的EHA105 单菌落，接种到LB（Rif 50mg/L，Km50mg/L）培养基中，28℃ 180rpm培养至OD600=0.5-0.8 时，取2mL菌液转
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移到50mL LB（Rif 50mg/L，Km 50mg/L）培养基中，培养到OD600=0.6-0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用同体积共培养基悬浮备用。 4.2.2 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化
采用叶盘法进行烟草的遗传转化，将切割的烟草叶片预培养2d后，置于含有重组质粒的根癌农杆菌侵染液中浸泡15min左右，期间不停轻轻摇晃，使叶盘切面充分接触菌液。取出叶盘，用无菌滤纸吸去多余菌液，将叶盘置于共培养基上，（26±2）℃，黑暗培养2-3d，然后将叶片转至含有潮霉素的筛选培养基上进行筛选的同时，诱导不定芽发生。
4.3 结果
将叶片放在含有30 μg/mL潮霉素的筛选培养基上进行培养，培养2周左右时，农杆菌侵染的叶片上诱导出抗性不定芽（图4.1右），而没有转化的对照叶片未能诱导出任何不定芽（图4.1左）。
图4.1抗性不定芽
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5、讨论展望
植物表达载体中应用最广泛的是CaMV35S组成型启动子，它导致外源基因在转基因植物中的所有部分和所有发育阶段都表达，不但造成能源浪费，还会引起植物的形态发生改变，影响植物生长。诱导型启动子是指由信号刺激而有转录活性的启动子。该类启动子可以快速有效地诱导转录基因的―开、关‖：可根据需要在植物特定发育阶段、组织器宫或生长环境下接受诱导信号，诱导基因表达；也可以随时解除胁迫，停止表达，使外源基因的表达处于人们的控制之下，既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。
本文实验以同源序列法克隆了葡萄CAN启动子，经测序，克隆到的启动子序列与预知序列只有少数碱基的差异，同源性达到97%，表明已克隆到葡萄启动子。将克隆的启动子与pBI1391Z连接，转入大肠杆菌细胞， 提取质粒进行酶切鉴定。结果表明，植物表达载体构建完成并将其命名为pBI1391Z-CAN。将其转入农杆菌细胞内，并利用农杆菌介导法对烟草进行了遗传转化。下一步的目标是进行筛选，并对抗性植株进行染色，观察其是否表达，然后进行组织表达分析，以确定其在生长发育过程中对逆境起到的具体作用。从而研究葡萄逆境胁迫诱导型启动子对植株生长发育的调控及在育种中的应用。
干旱、盐碱和极端温度(低温和高温)等是制约植物生长的主要逆境因子，逆境的存在会对植物产生水分生理产生影响从而制约植物的生长。克服干旱、盐碱和极端温度等在自然界中对植物造成的严重影响，选育具有拥较强的抗逆性的新品种，一直是各国研究学者努力的方向。
植物逆境胁迫抗性的功能基因经过多年的研究，技术和方法体系已趋于成熟，并研究得到了很多与植物抵抗逆境胁迫有关的基因位点和相关基因，几个转录因子、一些调节因子，随着研究的深入，我们将会对植物抵抗逆境胁迫的生理生化机理和分子机理有一个更为全面的认识，进一步掌握与抗逆相关的基因及其在代谢过程中和调控过程中的作用，更好的地选择植物在极端环境胁迫的抗性中在调控过程和代谢过程中重要的基因，应用在作物抵抗逆境胁迫的分子标记辅助育种和基因工程改良育种中。目前，对功能基因组的研究的更加成熟，可以从整体把握作物的抗逆机理的研究，为充分发挥分子标记辅助选育的优势，为转基因改良
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植物的抗逆性提供了新的理论基础和技术。
致谢
感谢青岛农业大学生命科学学院四年来的培养，在此，我真诚地向我尊敬的老师们和母校表达我深深的谢意！
这篇论文是在我的导师薛仁镐老师的多次指导下完成的。从选题到实验的安排以及实验细节，从论文内容到论文修改，都凝聚了他大量的心血。在这篇论文的写作过程中，薛仁镐老师不辞辛劳，多次对我就论文中许多核心问题作深入细致地讲解，教给我许多实验技巧，并全面细致的地修改了我的论文。薛仁镐老师对本论文从立题、实验安排、查阅文献到最后论文修改的每个细节都做了细致的讲解，并帮助多次修改论文，对此，我衷心表示感谢。薛老师丰富的知识以及诲人不倦的师者风范是我们毕生的学习楷模。在此，请允许我向尊敬的薛仁镐老师表示真挚的谢意！
其次，我要感谢魏璇师姐。在百忙之中抽出时间指导我做实验，帮助我搜集文献资料，帮助我理清论文写作思路，对我的论文提出了诸多宝贵的意见和建议。对师姐的帮助表示真挚的感谢。
在论文的写作过程中，也得到了许多同学的宝贵建议，同时还得到实验室其他师姐的支持和帮助。
最后，衷心感谢所有老师对我的栽培、支持和鼓励，感谢所有朋友的关心和帮助。向在百忙中抽出时间对此论文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心地感谢！
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