分子生物学课程教学讲义 朱玉贤(5)

2019-09-01 09:15

Adenosine-monophosphate变成Adenosine,或从GMP变成Guanosine。 二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine;

三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine; 四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine; 五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。 嘌呤代谢突变会引起重要疾病。

如人体内缺失adenosine deaminase,会引发严重的免疫缺失性疾病,因为此时T-淋巴和B-淋巴细胞不能正常发育。AD缺失后,细胞内dATP的含量将高达正常细胞中的100倍,而过量的dATP则抑制了其余dNTP在T-淋巴细胞中的合成。许多化疗(chemotherapy)药剂都针对核苷酸合成途径。如Azaserine和Acivicin都是Glutamine类似物,被用于阻断核苷酸的生物合成。

胸苷合成中的主要抑制剂有fluorouracil(氟脲)、methotrexate(氨甲基叶酸)和aminopterin(氨喋呤)。氟脲本身不是thymidylate synthase 抑制剂,但它在细胞中被转化为FdUMP以后,就能直接与TS相结合并使之失活。氨甲基叶酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制剂,氨甲基叶酸与该酶的亲和力比底物dihydrofolate高100倍。

二、氨基酸代谢

按所占的质量比例计算,N在生物体内的重要性排在CHO之后,列第4位。大量N元素都是有机氮,被结合于氨基酸或核苷酸分子中。

地球上的动植物共含氮约1.5×1010t,而每年通过硝化细菌以气态氮的形式释放到大气中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥厂每年生产的化肥仅含氮约108t,所以,如果没有生物固氮,生命很快就不复存在了。

1. 铵通过谷氨酸→谷氨酰胺被结合到有机物质中。 主要有两步反应:

⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP ⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+ 总结:

Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+ 因此,谷氨酰胺合成酶是氮代谢中的主要调控位点。

在大肠杆菌中,GS由12个相同的亚基(50kDa)聚合而成,其活性既通过构象变化,也能通过共价修饰的方式得到调节。Alanine,Glycine和其它至少6种gln代谢产物都是GS

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活性的变构抑制剂,每个抑制剂都只有部分抑制作用。除变构抑制之外,GS活性还受共价修饰调节。当第397位酪氨酸被腺苷化后(加上AMP),该酶更容易受变构抑制剂的反馈调节。

2.氨基酸的生物合成

高等动物不能合成大约一半氨基酸,只能从食物中直接获取这些必需氨基酸(Essential)。

表18-1 人体必需氨基酸(*.哺乳期至幼儿期必需) 表22-1 氨基酸合成的六条主要途径 3.氨基酸脱羧基化后生成有机胺。

许多重要的神经递质都是胺或其次生代谢产物。Tyrosine降解产物有dopamine(多巴胺),epinephrine(肾上腺素),norepinephrine,统称为Catecholamines(儿茶酚胺)。 4.精氨酸降解产生NO˙(Nitric Oxide)。

本世纪80年代,科学家发现NO是人体内重要的信号分子,它参与神经传递、凝血和血压调控等一系列生理反应。虽然它是气体,极易扩散,但由于它十分活跃,其扩散半径一般只有1mm。

三、氨基酸及功能蛋白质合成后的修饰

1.蛋白质刚刚被合成时,都以fMet(原核)或Met(真核)开始,多肽合成后,N端的formyl group、Met残基,有时还包括N揣多个残基或C端的残基都会被切除。50%的真核蛋白中,N-端残基的氨基酸会被N-乙基化。

2.切除信号肽。许多蛋白质都带有15-30个残基的signal peptides,负责指导蛋白质在细胞中的精确定位。 3.特定氨基酸的修饰。 4.氨基酸的糖苷化

5.氨基酸的异戊烯化(Addition of Isoprenyl Groups) 6.有些蛋白质还要与辅基(prosthetic groups)相结合;

Cytochrome C只有与血红素(heme)相结合才有功能。此外,Acetyl-CoA羧化酶常与Biotin分子相结合。有些蛋白质必须经蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白质只有在形成二硫键之后才有功能。

四、蛋白质的运输和降解

1、绝大部分被运入ER内腔的蛋白质都带有一个Signal peptide。该序列常常位于蛋白质的

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氨基末端,长度一般在13-36个残基之间,有三个特点: (1)一般带有10-15个疏水氨基酸; (2)常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸; (3)在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸,离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(Ala或Gly)。

研究发现,信号肽把Ribosome牵引到ER上。蛋白质合成之初,一旦信号肽序列的N端暴露在核糖体外,该序列(包括核糖体)就迅速与SRP(signal recognition particle)相结合,诱发SRP与GTP相结合,停止新生肽的进一步延伸(此时新生肽一般长约70个残基左右)。

受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牵引,这个复合物(GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽)立即向ER外膜靠拢,并通过peptide transport complex进入ER内腔。

5.Rough ER上的蛋白质常常通过运转载体将经过修饰的蛋白质送入高尔基体,再分别送到各个亚细胞位点。

6.蛋白质中的核定位序列一般不被切除。

蛋白质的核定位是通过多个蛋白的共同作用来实现的。Importin (α,β亚基)的作用有点像SRP受体。NLS蛋白-Importin复合物停留在核孔上,并在Ran-GTPase的作用下通过核孔。

细菌细胞内也存在类似的蛋白质运转系统。 7、蛋白质降解是一个有序的过程。

在大肠杆菌中,许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶(称为Lon)来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时,该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。

在真核生物中,蛋白质的降解需要Ubiquitin,一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统(Proteasome,Mr. 1×106)。

成熟多肽N-端第一个残基对蛋白质的稳定性有重要影响 。

五、DNA代谢

无论是只含有一对染色体的原核细胞还是带有多对染色体的真核细胞,只有整个基因组得到了完整准确的复制,细胞分裂才能顺利发生。所以说,DNA复制的起始,标志了细胞进入一个新的周期。

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㈠、DNA复制

根据反应阶段和所需的不同酶类,DNA的复制可被分为三个阶段,即复制起始、延伸和终止。每个DNA复制的独立单元被称为复制子(replicon),主要包括复制起始位点(Origine of replication)和终止位点(terminus)。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。

大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与,整个DNA复制机器被称之为DNA replicase system或replisome。

Helicase,任何DNA在被复制前都必须解开双链,这个过程是由helicase来完成的,它可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。

Topoisomerase,主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。 DNA结合蛋白,使新解链的DNA保持稳定结构。 Primases,为DNA复制提供RNA引物。

DNA polymerases,合成新生DNA链,切除RNA引物。

DNA Ligases,使新生DNA链上的缺口(3'-OH, 5'-p)生成磷酸二酯键。 1. DNA复制的起始

大肠杆菌中的复制起始位点是Ori C,全长245Bp,该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。

DNA复制起始中的主要步骤

a. 大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重复区相结合; b. 识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构;

c. DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合,可在不同方向同时起始DNA的复制。当细胞中存在足够的SSB和DNA gyrase时,DnaB的解链效率非常高。

整个DNA复制过程中,只有复制起始受细胞周期的严格调控。 \。\

DNA甲基化与DNA复制起始密切相关。OriC中有11个GATC回文结构(一般说来,256bp才应有一个GATC重复)。DNA子链被合成后,母链立即被甲基化(称为hemimethylated)。此时,oriC与细胞原生质膜相结合。只有当oriC被从膜上释放出来,子链被Dam甲基化后,才能有效地与DnaA蛋白结合,起始新一轮的DNA复制。复制起始可能还受ATP水解过程调控,因为DnaA只有与ATP相结合时才能与oriC区DNA相结合。

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2. DNA子链的延伸

主要包括两个不同但相互有联系的事件,即前导链和滞后链的合成。由DNA helicase解开双螺旋,由拓朴异构酶消除DNA链上的扭曲力,SSB结合使DNA单链稳定。 前导链的合成:由DnaG(primase)在复制起始位点附近合成一个10-60 nt的RNA引物,然后由polII把dNTP加到该引物上。

滞后链的合成:产生Okazaki fragments,消除RNA引物并由DNA pol I补上这一小段DNA序列,由DNA Ligase把两个片段相连。 3. DNA链的终止

当子链延伸达到terminus region(ter,带有多个20bp序列)时,DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井(trap),使复制叉只能进入,不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物(ter utilization substance)来完成的。 4. 真核细胞DNA的复制比大肠杆菌更复杂

真核生物的origin of replication被称为ARS-autonomously replicating sequences或者被称为replicators。Yeast replicators长约150dp,有多个保守重复区,共有约500个replicators分布于酵母的17条染色体中。

㈡、DNA的损伤修复

1. 错配修复(mismatch Repair)

错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达102-103,DNA子链中的错配几乎完全都被修正,充分反映了母链的重要性。

2. 碱基切除修复(Base-Excision Repair)

DNA gylcosylases能特异性识别常见的DNA损伤(如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化产物)并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸被称为AP位点(apurinic or apyrimidinic)。细胞中最常见的Uracil Glycosylase就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。 3. 核苷酸切除修复(nucleotide-excision repair)

当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤,导致双链之间无法形成氢键,由核苷酸切除修复系统负责进行修复。

4.DNA的直接修复(Direct repair)

㈢、DNA的转座

DNA的转座,或称移位(transposition),是由可移位因子(transposable element)介导的遗传物质重排现象。已经发现\转座\这一命名并不十分准确,因为在转座过程中,可移位

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