纤维素滤膜（DEAE）等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：
将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。 3． 细菌的转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ug DNA可得107-108个转化子。 4． DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：
①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。 b． Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)
该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。
该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应： 碱基的特异性修饰；
被修饰的碱基从核糖环上转移； 失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。
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专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。
硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的断裂。在碱性条件下，肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特异性切割。 c． DNA序列分析自动化
用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。
d.DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)
如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。
当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。所以，6-mer寡
核
苷
酸
矩
阵
class=\
href=\芯片\芯片只能用于测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 SBH的应用：
① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变； ② 可用于不同DNA片段之间的序列比较；
③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况； ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。
5． 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）
使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。
a. 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 b．寡核苷酸引物诱变
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应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。 C．PCRG与PCR诱变
6． 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.
a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay--EMSA)。
b． DNase I 印迹试验（DNase I foot printing） 主要步骤：
① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；
③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。
这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。
c． 甲基化干扰试验(Methylation interference assay)
用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。
d． 体内足迹试验
用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA链上的蛋白质结合区。
三、分子克隆技术
1、高质量mRNA的制备
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应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。 2． 反转录成cDNA
可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；
应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）； 应选用甲基化dCTP；
应保证所获得双链cDNA的方向性。
Super Script Choice cDNA合成系统中所用的poly（dT）引物
因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA- mcrB-菌株。
3．分子克隆的主要方法
（1）构建cDNA、核DNA文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因； （2）差式杂交(differential screen)和扣除杂交(subtractive hybridization)技术； （3）DD-RT-PCR法及差别显示技术；
（4）差别分析法 (RDA法，即Representational difference analysis）； （5）酵母双杂交体系Two-hybrid system；
（6）图位克隆法（map-based cloning）与染色体步移 （genomic DNA Walking）。
习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便属于同一克隆。细胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子克隆。
文库筛选与基因丰度有关。高丰度基因，如蚕丝心蛋白，卵清蛋白等在某些特定组织中可占细胞总mRNA量的50-90%，非常容易被分离。低丰度基因，一般在细胞中只有10-20个拷贝，哺乳动物细胞中可含10,000到40,000种不同的mRNA，如果要达到99%的期望值，大约需要筛选150,000-170,000个克隆子。一般情况下，每微克cDNA可产生10万-60万个克隆子。
A.差式杂交或扣除杂交克隆技术
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B.cRNA差式显示法
除了极少数特例(如组蛋白基因)之外，几乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都带有一段多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。
P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。 DDRT-PCR的主要步骤：
Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3'锚定引物作为反转录的
引物，合成第一键cDNA；
Ⅱ.用5'随机引物和某个3'端锚定引物对扩增第一链(掺入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带； Ⅳ.回收特异性差别条带；
Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；
Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带； Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis)
RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差式分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。
D.酵母双杂交体系
Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理：
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD则推
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