紫水晶：我最近养CHO-HUK细胞，这一个月来总是污染，有时是细密的东西，像是细菌；有时是霉菌，刚过滤的2000ml培养基都污染了，可以明显看到白色的菌落生长；再就是我的胎牛血清过期了一个月，发现里边有许多漂浮的异物，在镜下看是许多弯曲的东西，在孵箱里培养一天便混浊，应该也是细菌污染。我想请问：血清过期和污染有没有必然的联系？在这样潮湿闷热的天气里应该怎样预防和控制污染，大家有什么好办法？ little_G：可能的原因：
1、天气太热，实验者在培养和接种或者换液时出汗（有空调稍好，但是手也出汗）。 2、培养间里可能暗藏污染原。
3、注意培养箱（这点最重要），仔细检查培养箱里的隔板的下面，有可能有霉菌斑。（我遇到过） 4、培养基污染多数是配置过程中造成的，仔细检查配置过程用到的器具。
5、血清过期一个月，如果保存的好应该没有问题，但是保存不好，新来的血清，用一次就可能污染。血清过期和污染是否有必然的联系不好说，个人体会觉得其联系不大。 解决办法：
1、彻底清洁培养间，显微镜室。然后，紫外灯多照射一端时间消毒空气。
2、彻底清洁培养箱：（1）每个隔板仔细清洗，火烤。（2）培养箱大换水，换成新鲜干净的蒸馏水。（3）培养箱内壁用酒精棉球或者稀过氧乙酸认真擦洗。（4）紫外灯长时间照射（一天）。
3、实验用器械消毒：注意消毒时间和压力，有必要检查压力锅和校正压力表是否准确。 4、一次性手套在打开使用前一天放入无菌间照射消毒。 5、如果用双抗，应该现用现配。 6、注意过滤器的消毒灭菌。
7、过期的血清，可以做培养检查是否被污染。如有怀疑，建议不用。 8、检查培养间和超净台的通风过滤网，如果脏了，需要更换。
总之，潮湿闷热天气培养细胞非常容易污染，必须注意每一个环节。具体的可能造成污染的环节，还得要自己体会查找。 hdfi8d：
1、用碘伏仔细擦洗浮箱和操作台，地面，然后用紫外灯照1小时 2、处理完细胞放回浮箱是用酒精棉擦培养瓶的底部
happywind：我的一瓶价钱不是很贵的血清，用后总是发现培养基中有很细小的类似细菌污染的东西，但是培养液又不很快变浑，不像细菌污染，细胞长的也慢，现在想想也许就是血清的问题吧，养细胞血清的选择还是很重要。 避免污染，我认为：
1、每次做完实验，超净台要用酒精喷擦；打开紫外线照射； 2、严格无菌操作； 3、孵箱定期清洗，换水；
4、每次观察细胞后，酒精喷瓶口；
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5、培养瓶最好放在一个托盘上，然后在放入孵箱。托盘是高压蒸汽消毒过的。
limengqiang：防止细胞污染很简单，只要按照外科手术的操作原则进行无菌才操作，保证污染不了。
olivezrp：还有 一个 问题，就是血清用之前是否灭活过。很多公司的血清 ，分装 之前 需要灭活，不是一定要灭活 的，但如果 你 没有 灭活，即使没有污染，镜下也 可见 许多 漂浮物，一般为 衣原体、支原体等，建议血清分装前，56度水浴 灭活30分钟。
guanping：倒置显微镜一般是看不到\许多 漂浮物，一般为 衣原体、支原体等\的,关于血清污染:买回来后(进口的一般不需要灭活),溶解后分装一小瓶,培养箱里72 h 以上,即可看到污染与否(没有污染的应该是透明度很好的).如果有问题,就退货,没有话说.如果发现溶解后即可看到明显的漂浮生物,呢就不用我说了。使用过程中,最好分成小瓶,用个1 周左右,4 度保存!反复冻融,对其效果和性状有影响.
brisk2004 ：我最近也碰到了这样的问题，养的815细胞总是污染，把培养基，胰酶等什么都丢了也不行，后来我发现培养箱里面长霉了，清洗灭菌之后才没事了。
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新购进细胞株的问题
来源：互联网
正在定购MG63 ，即人成骨头瘤细胞，但是以前没买过，都是从别人那直接扩培的，所以对于刚拿到细胞株要做的不清楚，恳请有经验的战友提供帮助。 打算买三瓶，新购进时应该会配培养基，那我是否需要提前配培养基（按厂家提供的培养基配方，是一拿到手直接冻到液氮里吗？还是先培养几天再冻？查文献发现很多种培养基都可以用，可否用实验室已有培养基培养，大约需要多久后才能用实验室的培养基培养。
对于新买的细胞，必然是有说明书的，建议先定购说明书中的培养基，扩增后可以试试其它的培养基，当然是因为经费的问题。一拿到手可以先放到液氮里面，如果不能充分准备后马上培养。最好你扩增到第3代后用实验室以前用过的培养基。 收到复苏状态的细胞后的注意事项：
1、收到细胞后，在操作时用75酒精将培养瓶外面擦洗消毒。
2、收到细胞后，瓶中老培液和培养瓶均不能重复使用，全部换用新的培液，将细胞移至新的培养瓶。
3、通常供应细胞方的培液不会加任何抗菌素，在收到细胞后进行换液或传代时，视情况在培液中加双抗（100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素）。
4、对一些贴壁不牢地细胞，可重新吹打，离心（1000rpm/min，3分钟），接种。
5、在没拿到细胞前，先了解清楚细胞特性，培养方法等细节，不要等到细胞到了手忙脚乱的。关于细胞特性和培养方法可多参考ATCC网站介绍。http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/tabid/112/Default.aspx 6、ATCC已经修改了大部分细胞的储存条件，用原来可以存放液氮液体环境，改成了建议储存液氮气相环境。
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细胞的复苏经验总结
来源：丁香园
在细胞复苏过程中，有多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下，望能为同行提供些参考。 【材料】
1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。
2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）。 【操作程序】
1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。
2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。 3.二甲基亚砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，备用。
4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。 5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。 6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。 7.记录复苏日期。 【注意事项】
1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。
5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
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