三、研究方案
（一）总体研究思路、技术路线及可行性分析
1. 总体研究思路
在细胞增殖过程中遗传物质的稳定性有赖于细胞周期的系统调节，DNA的精确复制和DNA损伤的修复。蛋白质群在此过程中的相互作用使细胞周期的精密调控成为可能。机体通过细胞周期调控维持基因组稳定性，这一过程是经由细胞周期的各个环节实现的。细胞周期分为G1、S、G2和M期，研究细胞周期的调控应该分解到细胞周期自然过程的各个环节中。细胞周期调控的正常进行以及遗传物质的稳定性与肿瘤的发生以及衰老等生命重大事件密切相关。因此，鉴定参与调控细胞周期各个环节的蛋白质群并且评价这些蛋白质群在调控细胞周期的各个阶段、维持基因组稳定性中所发挥的作用机制以及蛋白质群之间的相互作用对于癌症等重大疾病研究至关重要。对我们认识与了解这些疾病发生的机理，有效防治这些疾病具有重大意义。
基于以上思路，本课题重点围绕细胞周期的各个环节相关蛋白质群开展研究，阐明这些蛋白质群在细胞周期各个时期：DNA复制、合成、有丝分裂期的调控机制。评价蛋白质群对于细胞周期调控正常进行，维持遗传物质稳定性中的作用。在此基础上，我们将利用一个大型高通量蛋白质分析平台，大规模鉴定和分析与细胞周期调控和维持基因组稳定性相关的蛋白质群，探究其相互作用蛋白和信号转导途径。此外，我们还将研究多细胞生物如何处理细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况下而对细胞命运进行调节，探讨细胞生存、死亡与遗传物质稳定性的综合关系，即在细胞周期失调、基因组不稳定的情况下通过何种机制调控细胞命运，对细胞生存和死亡进行决断。这将不仅阐释机体清除癌细胞的机制，还将为癌症治疗提供更多的靶向药物选择。
课题1细胞生长和DNA复制相关蛋白质群课题2有丝分裂和DNA修复相关蛋白质群课题3细胞异常增殖相关蛋白质群课题4调节细胞增殖和凋亡蛋白质群
附图：主要技术途径流程图
2. 技术路线
根据我们的学术思路，本项目的总体研究技术途径如附图所示。研究细胞周期的各个时期相关蛋白质群的结构、功能、调控机制和相互作用，并且阐述细胞正常增殖过程中遗传物质稳定性的维持。还将研究细胞异常增殖中蛋白质群的变化和细胞凋亡的程序控制。主要途径为：【课题一】用遗传的方法筛选Sap1温度敏感株的抑制蛋白；直接从细胞内分离Sap1的蛋白复合体；用蛋白亲和层析的方法分离Sap1的相互作用蛋白。并用生化，遗传及荧光单分子技术阐明一些已知及一些新确定的DNA复制蛋白的生化作用机理；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理以及Cds1-Dna2的检验点通路，用基因干扰技术（RNAi）揭示该通路相关的检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。采用基因表达谱芯片或蛋白组学的方法，与课题二和课题三合作，筛选受GSK-3β调控的基因或蛋白质群，鉴定G1、S期细胞中新的受GSK-3β调控的基因或蛋白质群并且探讨其机制和意义。【课题二】确定PTEN在维持有丝分裂检验点中的重要地位，利用基因芯片技术鉴定出新的PTEN调节基因群并且深入了解其调控机理。采用染色质-免疫共沉淀（Chromatin-Immunoprecipitation, ChIP）方法确定PTEN与染色质之间的相互作用从而探讨PTEN调控其靶基因表达的机理。利用蛋白质Pull-down分析系统大规模鉴定与PTEN相互作用的有丝分裂相关的蛋白质群。通过传统的蛋白质-蛋白质相互作用实验（IP-western）、定向诱变、荧光素酶分析等方法检测PTEN与这些新鉴定出的有丝分裂相关蛋白质群的物理性相互作用，利用课题组三的蛋白质分析平台鉴定PTEN与这些蛋白质群物理性相互作用的结构域及蛋白质修饰位点。通过建立小鼠动物模型从活体角度综合评价PTEN通路以及相关蛋白质群在调节有丝分裂进程、维持遗传物质稳定性的重要性。最后利用这一动物模型揭示抑癌基因p53与PTEN的分子网络关系及其在抗癌过程中的作用。【课题三】以癌症和衰老模型为主要研究对象，探讨在细胞异常增殖过程中相关蛋白质群，如Mig-2信号通路的变化规律。通过对目的基因进行表达干预（过表达或沉默），从体外到体内深入研究候选蛋白质群对细胞增殖、细胞周期调控的影响。结合信号通路的特异性抑制药物等分析目的基因表达干预后导致的新差异蛋白及所涉及的信号通路。采用TAP技术并结合质谱分析筛选和鉴定出差异蛋白的相互作用蛋白或蛋白复合体。利用稳定同位素标记并结合高灵敏度的生物质谱鉴定技术，研究细胞核蛋白质和DNA片段上的修饰类型、修饰位点，阐明其信号转导机制及其在衰老过程中的功能。采用在体鉴定快速肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的实验系统，提高甄别在细胞周期中调控异常增殖蛋白质群的效率。选择调控细胞异常增殖的代表性新蛋白，建立其与肿瘤病人的相关性。【课题四】研究Hippo信号通路调控细胞增殖和细胞凋亡的分子机理，揭示Hippo信号通路核心分子对基因组稳定
性的调控机制，分析Hippo信号通路蛋白与微管结合蛋白的关系及其在调控细胞增殖和凋亡中的作用。在全基因组水平上通过干扰基因的表达（RNAi）筛选Hippo调节蛋白质群，并结合微阵列分析鉴定Hippo通路新的靶基因集团；通过上位分析（epistasis）和IP-Western等方法在体内与体外研究Hippo通路组成分子间的动态互作；通过质谱分析鉴定蛋白修饰，特别是磷酸化修饰调控Hippo通路的分子及生物学意义；系统分析Hippo通路蛋白质组群在细胞内的定位情况及转位意义；分析CYLD和EB1等微管结合蛋白与有丝分裂、细胞增殖以及基因组稳定性之间的关系；通过蛋白共定位研究探讨Hippo通路与PTEN调节基因组稳定性的关系，从而探讨多细胞生物在细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况下如何对细胞命运进行调节。各课题组还将充分利用课题组三具备的大型蛋白质鉴定分析技术平台对更多参与维持基因组稳定性的蛋白质群进行大规模鉴定和分析。
3. 可行性分析
(1) 本项目的科研队伍以从事生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学等国家和部门重点实验室、教育部985创新平台为主体，集中了目前从事基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群研究的优势科研团队。其中，各课题负责人都是本领域的专家，亲自设计各自的课题并将指导项目的具体实施。
(2) 本项目着眼于大规模蛋白质组（群）而非单个蛋白的研究。2007年10月召开的国际蛋白质组学组织大会标志着从大规模技术性研究向差异和动态组学研究的趋势。但迄今已有的技术几乎都限于检测和比较蛋白的累积量。课题三近期自主建立的SiLAD 技术对蛋白真正表达水平差异的测定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用稳定同位素同时掺入细胞核蛋白质和DNA上新添甲基的系统研究方法已成熟地用于本课题相关模型的研究中。这些新技术方法都是针对细胞调控中的蛋白质组（群）动态研究而开发的。本研究具备扎实的前期研究工作基础和创新技术平台，以及用于功能研究的基因敲除动物模型和高精确度的质谱分析鉴定蛋白质动态表达和蛋白质修饰平台。良好的工作基础和强大的蛋白质组学技术平台为本课题研究计划的顺利进行提供了有力的保障。
(3) 参加本项目研究的各实验室具备优良的研究条件。同时，各课题间早已经形成了紧密的协作关系，各方面的研究相互交叉、组成了一个有机的整体。课题二中建立的基因敲除小鼠模型以及转基因小鼠模型在国际上也具有领先地位，为其他课题顺利实施提供了珍贵的活体动物模型。课题三的高通量蛋白质鉴定和分析平台为其他各个课题组的研究分析提供了可靠、高效的技术平台。
（二）创新点
1. 本项目瞄准国际前沿，面向国家需求，综合利用多学科优势，集中针对遗传物质稳定性相关蛋白质群的分子调控网络和相互作用，展开多层面更又互相关联的研究。
2. 本项目将细胞周期的各个时期有机地整合在一起，通过研究各个环节相关的蛋白质群及其调控和相互作用机理而探讨这些蛋白质群对细胞周期调控的分子机制，评价其作为有机整体和分子网络对遗传物质稳定性的相关性，在此基础上大规模鉴定和分析与细胞周期调控相关的各种蛋白质群，并探索这些蛋白质群之间的相互作用，构建与细胞周期调控和基因组稳定性维持相关的蛋白质组分子调控网络。此外，还进一步研究当细胞周期失调发生遗传物质不稳定后，多细胞生物作为有机整体利用何种机制对细胞命运进行决断，从而综合性评价细胞周期调控与基因组稳定性的内在联系和相关蛋白质群的功能和相互作用。
3. 本项目在研究内容方面具有完全创新性：孔道春实验室在裂殖酵母S. pombe发现了DNA复制起始蛋白—Sap1，他们证明Sap1是DNA复制起始蛋白Cdc18结合到DNA复制源上所必需的。康铁邦教授在细胞周期和DNA损伤检测点中，发现了一条新的调控通路（GSK-3β-Cdc25A），该通路在G1、S期和G1-S期转换中起关键作用。尹玉新课题组研究设想PTEN对细胞周期有丝分裂形成独特的调节，而这种调节在国际上也是全新发现。张宏权课题组发现跨膜受体整合素结合蛋白Mig-2是细胞跨过有丝分裂中期（Metaphase）所必须的，并证明这一作用是通过一个全新的Mig-2－ILK信号通路调控的。肖雪媛和纪建国课题组以肿瘤和衰老为实验模型，研究新发现的与细胞增殖异常相关蛋白的生物学功能及组蛋白修饰变化规律。而以此为基础构建靶蛋白表达干预后的交替多轮差异蛋白筛选策略。
4. 本项目在研究方法方面也具有独到之处，在国际上处于领先水平。尹玉新课题组在多年的研究基础上，发展了一系列体内、体外活体研究模型，例如小鼠基因敲除模型系统：他们已经成功敲除PAC1基因（p53下游的一个重要基因）并且建立了一系列PTEN条件基因敲除knock-in模型，通过这些模型检测PTEN在肿瘤发生过程中如何调节有丝分裂，研究PTEN与相关蛋白质群作用，而这些作用可与特定小鼠模型的肿瘤发生直接关联，从而更加直观地评价PTEN调控有丝分裂的作用与肿瘤发生有无直接关系。此外，他们正在建立转基因小鼠模型预测某些重要蛋白过度表达是否可促进肿瘤发生。张宏权课题组首次在斑马鱼模型中建立了在3－7天内在体鉴定肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的实验系统，为增殖异常的肿瘤细胞进行大规模体内评价提供了快速、经济和方便的最新方法。肖雪媛课题组则首次提出使稳定同位素同时掺入细胞核蛋白质和DNA上新添甲基的系统研究方法，从而可以快速、定量鉴定表观遗传修饰的动态变化，这将有助于组蛋白修饰密码及其作用机制的确定。
（三）课题设臵
课题一：真核细胞DNA复制机理及细胞周期检验点在维持遗传物质稳定性中的作用
研究目标：
本课题将研究真核细胞DNA复制及检验点维持遗传物质稳定性的机理，确定DNA复制起始蛋白Sap1的相互作用蛋白及阐明它们的生化功能；确定人细胞的Sap1同源蛋白；大规模确定新的DNA复制蛋白；阐明Dna2维持DNA复制叉稳定的机理；阐明Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。阐明Cds1-Dna2的检验点通路，揭示检验点在维持复制叉稳定的作用；鉴定G1、S期细胞中新的受GSK-3β调控的基因或蛋白质群及其机制和意义。 研究内容：
1. 确定Sap1的相互作用蛋白和人细胞的Sap1同源蛋白并阐明它们的生物功能和生化作用机理。
采用下面三种方法确定Sap1相互作用蛋白。一是用遗传的方法筛选Sap1温度敏感株的抑制蛋白；二是直接从细胞内分离Sap1的蛋白复合体；三是用蛋白亲和层析的方法分离Sap1的相互作用蛋白。
2. 确定新的DNA复制蛋白
在裂殖酵母S. pombe, DNA复制起始蛋白Cdc18的高表达导致DNA重复复制并最终使细胞死亡。如果另一个复制蛋白由于突变使得它的活性降低，该蛋白就能拮抗Cdc18的高表达导致的DNA重复复制从而使细胞能存活。用该方法已经筛选到了几百个突变株，现正确定它们的突变基因，并进一步与课题组三合作，利用高通量蛋白质鉴定分析平台研究新的DNA复制蛋白的相互作用及其生物学功能。
3．阐明Cds1-Dna2的检验点通路
已发现Dna2能防止停顿的DNA复制叉倒转，也发现Cds1调控Dna2和DNA的相互作用，但Cds1和Dna2不直接相互作用。这暗示Cds1通过调控另一个蛋白达到促使Dna2结合到DNA上。采用生化和遗传的方法确定该蛋白，并最终阐明Cds1-Dna2的检验点通路。
4．鉴定新的GSK-3β底物，及其机理和调控机制
本课题组最近发现，在DNA损伤时GSK-3β在S期的调控中也起重要作用。将用基因表达谱芯片或蛋白组学的方法，鉴定新的受GSK-3β调控的基因或蛋白质群，并挑选适当的功能基因或蛋白，在细胞水平和整体水平（动物模型）进行分析、验证，并探讨其作用机制及意义。同时，本课题组还发现GSK-3β可能通过磷酸化Cdh1调节APCCdh1的活性，从而调控有丝分裂的过程。本课题拟鉴定Cdh1