四、年度计划
第一年：
研究内容
1. 筛选与Sap1、Cds1和Dna2相互作用的蛋白，并且大规模鉴定和DNA复制有关的蛋白。
2. 建立稳定高表达GSK-3β或RNA干扰GSK-3β的Hela细胞系。 3. 确定TAP的最佳条件，以便最大限度地纯化出GSK-3β相互作用蛋白。 4. 基因芯片法筛选出差异基因群，该基因群可能在转录水平直接或间接受GSK-3β的调控。
5. 着手研究GSK-3β磷酸化Cdh1的具体位点，及其意义。
6. 创建一系列GFP-PTEN质粒，以使其在结构上具有AcGFP1编码序列。将这些pAcGFP载体转染Pten+/+ MEFs或HeLa细胞。对细胞周期中不同时期的细胞进行分析以获得PTEN动态定位的足够信息。
7. 在含有野生型PTEN和PTEN缺陷型的不同细胞系中对动粒功能进行分析。 8. 建立PTEN敲除MEFs系统和PTEN诱导表达系统。通过Western Blot和Northern分析检测PTEN缺失和PTEN诱导表达的细胞中p53蛋白及其mRNA的水平。
9. 通过基因表达干预等方法从体内外系统研究与肺癌发生和转移密切相关蛋白S100A7、S100A11和PHP14等的生物学功能。
10. 建立神经细胞衰老和衰老模型，制备不同发育或分化阶段的样品材料，进行亚细胞器分级实验，提取关键蛋白质组分。
11. 在mRNA和蛋白质水平核实鉴定Mig-2上调的促肿瘤生长和侵袭转移的蛋白质群，并在肿瘤病人标本上建立相关性。 12. 利用微阵列方法鉴定Hippo通路靶蛋白集团。 13. 合成双链RNA，构建果蝇RNAi文库。
14. 完成Hippo通路主要已知组成蛋白如Hpo、Sav、Wts、Mats、Yki等及微管结合蛋白蛋白Rassf、CYLD、EB1等GFP融合蛋白表达载体的构建，分析上述蛋白的细胞内定位、共定位与转位情况。
15. 分析微管结合蛋白对细胞周期进程的影响，检测微管结合蛋白在肿瘤和对照组织中表达水平的变化及其表达对反映细胞生长或死亡的克隆形成率的影响，并通过BrdU整合实验等，分析微管结合蛋白表达对细胞增殖的影响。 16. 制备并纯化Wts磷酸化抗体。
预期目标
1. 质谱确定和Sap1相互作用的候选蛋白。筛选得到一些和Cds1和Dna2相互作用的蛋白。筛选得到~100个突变株。并开始突变株的形态分析、开始突变株突变基因的确定。
2. 分别得到3株以上稳定高表达GSK-3β或干扰GSK-3β的Hela细胞系。 3. 初步确定TAP的最佳条件.
4. 筛选出干扰GSK-3β后表达差异的基因群。
5. 确定GSK-3β磷酸化Cdh1的具体位点，初步确定GSK-3β磷酸化Cdh1的意义。
6. 揭示动粒中PTEN的精确定位。
7. 确定PTEN缺失是否会导致染色体凝集和集合障碍，动粒-微管相互作用受损以及纺锤体检验点应答障碍。
8. 完成不同PTEN状态下p53蛋白及其mRNA水平的测定分析，确定PTEN如何控制p53转录。
9. 确认S100A7、S100A11和PHP14在肺癌发生和/或发展中的生物学作用。 10. 获得不同发育和衰老阶段的亚细胞器样品。
11. 选择2-3个Mig-2上调的与肿瘤增殖和侵袭有关的转录因子，阐明其调控机制。
12. 得到Yki过量表达后靶蛋白表达增加与减少的顺序列表，分析得到3-5个候选蛋白用于进一步分析。
13. 完成约5，000个果蝇基因双链RNA的制备。
14. 获得Hippo通路主要组成蛋白细胞内定位、共定位和转位情况，完成对Hippo通路与微管结合蛋白相互作用分子网络的解析。
15. 获得微管结合蛋白对参与调控细胞增殖与凋亡机制的了解。 16. 得到Wts磷酸化抗体。
第二年：
研究内容
1. 用体外生化方法，验证和Sap1相互作用的蛋白。着手开展这些蛋白基因的突变株的筛选。开始筛选人细胞的Sap1同源蛋白。
2. 对第一年筛选的突变株进行形态分析，确定突变株的突变基因。DNA序列分析确定突变基因的突变位点。序列对比分析这些基因表达的蛋白及可能的功能域。
3. 体外验证和Cds1及Dna2相互作用的蛋白。研究Cds1和 Dna2通路的中间蛋白。着手开始筛选这些蛋白的突变株并开始功能分析。
4. 利用生物信息学找出其中与细胞周期、DNA损伤监测点的调控或与肿瘤发生
发展相关的基因群。
5. 利用RT-PCR在翻译水平验证该基因群；利用Western blot在蛋白水平上验证。 6. 以TAP大规模纯化GSK-3β高表达细胞Hela细胞系与对照Hela细胞系裂解蛋白，SDS-PAGE检测差异蛋白群，LC-MS以及生物信息学鉴定出差异蛋白群。
7. 深入探讨GSK-3β磷酸化Cdh1的对细胞周期的影响及其意义。
8. 将pcDNA3/PTEN转染Pten-/- MEFs并且通过Western分析证实异位PTEN表达，通过免疫荧光法和活细胞成像对上述细胞中的染色体排列和分离进行监测。
9. 采用epitope-tagging策略从人类乳癌MCF-7细胞中分离纯化在核内与PTEN存在特异性相互作用的新的有丝分裂因子。对所得蛋白进行质谱分析后搜索蛋白数据库进行鉴定。
10. 采用染色质免疫共沉淀法（ChIP）检测PTEN与p53启动子DNA物理上的关联。荧光素酶分析法检测PTEN对p53启动子的转录调控。进行Dnase I指纹图谱分析，通过核心指纹图谱系统精确限定PTEN与p53启动子的结合区域。在p53启动子区域构建一系列的缺失来缩小PTEN结合的最小的必需序列。
11. 在第一年工作的基础上，采用TAP技术对S100A7、S100A11和PHP14等相互作用蛋白或蛋白复合体组分进行筛选，并对获得的候选蛋白进行质谱鉴定。通过免疫共沉淀等方法对其中感兴趣的候选蛋白进行验证。
12. 对不同阶段细胞进行稳定同位素定量标记研究，收集研究材料进行亚细胞器分级，初步分析标记效率和蛋白质表达情况，利用质谱鉴定部分蛋白质。 13. 通过免疫共沉淀并结合质谱技术，发现新的Mig-2相互作用蛋白质、制备抗体，揭示mig-2本身调控肿瘤细胞增殖和侵袭的分子机制。
14. 通过免疫组化分析的方法在体内验证Hippo通路调控新靶蛋白的表达并确定其参与的生物学过程。
15. 合成双链RNA，构建果蝇RNAi文库。
16. 利用果蝇RNAi文库、通过western blotting方法观察Wts磷酸化水平的变化筛选Hippo通路调控蛋白。
预期目标 课题一：
1. 确定和Sap1相互作用的蛋白。得到1或2个和Sap1相互作用的蛋白的基因条件突变株。得到和人细胞Cdc6蛋白相互作用的候选蛋白。
2. 完成突变株的形态分析。 完成突变株的突变基因的确定。 完成序列对比分
析及蛋白功能域的确定。
3. 确定Cds1及Dna2相互作用蛋白。敲除它们的基因。完成突变株的形态分析。 4. 验证出3-5个与细胞周期、DNA损伤监测点的调控或与肿瘤发生发展相关受GSK-3β直接或间接调控的基因。
5. LC-MS鉴定5-10个TAP纯化的差异蛋白。
6. 确定GSK-3β磷酸化Cdh1的对细胞周期的影响及其意义。
7. 确定在Pten缺陷型细胞中过度表达PTEN是否能校正染色体错排和分离错误，以及恢复动粒功能和检验点应答。
8. 分离纯化若干个与PTEN相互作用的有丝分裂相关蛋白，并查询其基本生物功能。
9. 确定PTEN调节p53转录的分子机制。
10. 获得若干个S100A7、S100A11和PHP14的相互作用蛋白或蛋白复合体组分。将其中一些蛋白将申请专利。
11. 将稳定同位素标记进入细胞各亚细胞器，获得蛋白质的动态表达数据。 12. 获得Mig-2调控的新信号通路并建立相关信号通路与肿瘤病人的相关性。 13. 确定3-5个候选靶蛋白在Hippo通路调控细胞增殖与凋亡中作用。 14. 完成另外约5，000个果蝇基因双链RNA的制备。
15. 完成Hippo通路调控蛋白的筛选，分析选择3-5个候选基因用于下一步分析。 16. 培养研究生8名，培养博士后4名。发表IF>10的论文4篇，IF>5的论文16篇。申请专利4项。
第三年：
研究内容 课题一：
1. 开始Sap1相互作用蛋白的功能分析。验证和人细胞Cdc6相互作用的蛋白。 2. 研究这些蛋白在细胞生长过程中的动态变化。研究它们是否是DNA复制必需的蛋白。研究它们是作用于DNA复制起始阶段还是DNA合成延长阶段。 3. 着手开展研究Cds1及Dna2相互作用蛋白在维持DNA复制叉稳定性中的作用。
4. 研究3-5基因芯片筛选的个蛋白在翻译水平上受GSK-3β调控的方式及其机理（直接调控还是间接调控）。
5. 评价该3-5个蛋白对细胞周期调控、DNA损伤监测点调控的作用，或对肿瘤的发生、发展中的作用。
6. 细胞水平验证TAP-LC-MS发现的GSK-3β相互作用蛋白的相互作用（免疫共沉淀实验、GST pull-down实验等）
7. 从PTEN+/+ MEFs和PTEN-/- MEFs中提取RNA，逆转录为cDNA，采用生物素标记探针对芯片进行杂交。比较整体基因表达谱与PTEN功能的关系。 8. 采用细菌表达的蛋白（GST-PTEN，GST和候选蛋白）进行体外GST pull-down分析。建立HA-标记的鉴定蛋白细胞系，在该细胞系中，或瞬时转染PTEN表达载体及HA-标记的鉴定蛋白的细胞中进行体内免疫沉淀和western blot分析。
9. 构建含有PTEN磷酸酶活性失活的哺乳动物表达质粒，检测p53的产生是否依赖于PTEN磷酸酶活性，同时检测存在或缺失PTEN时p53是否发生活化。利用免疫沉淀（IP-Western）检测AKT和p53之间的物理相互作用。 10. 采用免疫共沉淀等方法对候选的相互作用蛋白进行验证，从中选取1-2个感兴趣蛋白或是功能未知蛋白，通过基因转染等方法对其进行生物学功能分析。 11. 利用多种质谱系统如MALDI TOF/TOF MS和LC-MS/MS系统鉴定不同衰老阶段的蛋白质动态表达和修饰，鉴定修饰位点和修饰类型，进行氧化修饰和组蛋白质及和蛋白质修饰分析。
12. 通过蛋白质相互作用技术，结合使用抑制剂和细胞实时图像技术，揭示Mig-2调控细胞周期M-entry和Spindle assembly的分子机制。
13. Hippo通路候选调控蛋白体内外功能分析。构建候选蛋白转基因和敲基因动物模型，观察其表型特点；利用免疫共沉淀等方法确定候选蛋白与Hippo通路已知蛋白之间的相互作用。
14. 通过细胞共转染、蛋白分离纯化和质谱分析鉴定Hpo磷酸化Sav的关键磷酸化位点，构建关键位点突变的转基因和敲入（knock-in）果蝇模型，分析磷酸化位点的功能。
15. 分析Hippo信号通路主要蛋白与线粒体功能的相互关系，如Hippo通路蛋白与线粒体蛋白的共定位情况、Hippo通路对线粒体功能的影响、线粒体对Hippo通路激活机制的影响。 16. 整理分析数据，撰写论文。
预期目标
1. 确定Sap1相互作用蛋白是否在DNA复制起始中起必需作用。 验证和确定人细胞Cdc6相互作用的蛋白，即人细胞Sap1的同源蛋白。
2. 确定这些和DNA复制过程相关蛋白在DNA复制过程中的作用阶段。 3. 确定Cds1和Dna2之间的通路。
4. 初步阐明5-10个基因在翻译水平上受GSK-3β调控的方式及其机理。 5. 初步阐明3-5个受GSK-3β调控的基因对细胞周期调控、DNA损伤监测点调控的作用，或对肿瘤的发生、发展中的作用。