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课题1微生物的实验室培养
1.培养基中含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子等营养物质。
2．实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。
3．固体培养基的配制过程为：计算―→称量―→溶化―→灭菌―→倒平板。
4．平板划线法和稀释涂布平板法是微生物接种的常用方法。
5．消毒的目的是杀死物体表面或内部一部分对人体有 培养基及无菌技术 害的微生物；灭菌则是杀死物体内外所有的微生物，包括 ] [孢子和芽孢。自读教材·夯基础1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养物质。
(3)营养成分：水、无机盐、碳源、氮源，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净培养物。 (2)关键：防止外来杂菌的入侵。 (3)不同对象的无菌操作方法[连线]：
1．下面是查氏培养基(培养霉菌所用)的主要成分，请根据下述培养基，回答下列问题：
蔗糖 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4 琼脂 水 15 g 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 15～20 g 定容至1 000 mL (1)该培养基根据物理性质划分应是什么培养基？为什么？ 提示：固体培养基。因为该培养基加入了凝固剂琼脂。
(2)该培养基包含微生物生长和繁殖所需要的几类营养物质？分别是什么？ 提示：4类物质。分别是碳源、氮源、无机盐和水。
(3)蔗糖提供的是哪类营养物质？NaNO3提供的是哪类营养物质？ 提示：蔗糖提供的是碳源。NaNO3提供的是氮源和无机盐。
(4)在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物所需要的哪些条件？
提示：满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需要。
2．探讨培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶所采用的灭菌或消毒方法。 提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。
3．消毒与灭菌的相同点与区别分别是什么？
提示：消毒是杀灭病原微生物和有害微生物，并不要求杀灭一切活的微生物；而灭菌则是杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
[跟随名师·解疑难]
1．培养基的成分 营养物质 定义 凡能提供所需碳元素的物质 作用 构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些主要来源 无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂碳源 是异养生物的能源物质 肪酸、花生粉饼、石油等 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 氮源 凡能提供所需氮元素的物质
生长因子 生长必不可少的微量有机物 在生物体内含量很高 酶和核酸的组成成分 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 维生素、氨基酸、碱基等 水 外界摄入 为微生物提供除碳、无机盐 氮以外的各种重要元素，包括大量元素 2.实验室常用的消毒和灭菌方法 项目 概念 无机化合物 常用方法 煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 应用范围 一般物品 使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物消毒 体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子) min 巴氏消毒法：在70～75 ℃煮30 min 一些不耐高温的液体，或在80 ℃煮15 min 化学药剂消毒法 如牛奶 如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等 紫外线消毒法：紫外灯照射30 min 接种室、操作台 使用强烈的理化因素杀死物灭菌 体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼烧灭菌：酒精灯火焰 干热灭菌：在160～170 ℃下灭菌1～2 h 高压蒸汽灭菌：在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，灭菌15～30 min 接种工具的灭菌和试管口的灭菌 玻璃器皿、金属工具的灭菌 培养基及容器的灭菌 大肠杆菌的纯化培养 [自读教材·夯基础] 1．制备固体培养基
2．纯化大肠杆菌 (1)方法：
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(2)鉴定：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37_℃恒温箱中，培养12 h和24 h后，分别记录观察。
(3)菌种保存：
对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏法；对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏法。
1．培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度？
提示：可以用手触摸，感觉上以刚不烫手为准。 2．如果需要调节培养基的pH，应在哪一步骤后进行？ 提示：溶化后，灭菌前。
3．在用平板划线法接种大肠杆菌时，第一次划线前、每次划线前及划线操作结束后，都要灼烧接种环，请分析其目的分别是什么。
提示： 第一次灼烧 每次划线前灼烧 划线结束灼烧
杀死上次划线结束后接目 的 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 种环上残留的微生物，使每次划线的微生物来自上次划线末端 4．在纯化大肠杆菌操作中，如何验证培养基灭菌是否彻底？ 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 提示：将接种后的培养基和一个未接种的培养基，都放在37 ℃恒温箱中培养，观察并记录结果。
[跟随名师·解疑难]
1．微生物培养中有关实验操作的注意事项 (1)倒平板操作：
①培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 ℃以下凝固。 ②培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。 ③整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
④平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染。 ⑤若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个平板应丢弃。 (2)平板划线操作：
①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。 ②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。 ③划线时最后一区域不要与第一区域相连。
④划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。 2．稀释涂布平板操作
(1)稀释操作时：每支试管及其中9 mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。
(2)涂布平板时：稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：
①酒精灯与培养皿的距离要合适。 ②吸管头不要接触任何其他物体。 ③吸管要在酒精灯火焰周围使用。 3．平板划线法和稀释涂布平板法的比较 项目 平板划线分离法 稀释涂布平优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特缺点 不能计数 吸收量较少、较麻烦，平板不适用范围 适用于好氧菌 适用于厌氧菌