荧光探针的合成及自由基检测研究
1 绪论
1.1 引言
荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增, 其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点, 且荧光现象具有有利的时间表度。 当物质吸收紫外光和可见光后, 它的电子能级跃迁至激发态, 然后将这一部分能量释放出来, 接着返回基态。 由于物质分子结构不同, 所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同。利用这一特性, 可以定性鉴别物质。研究分子的荧光光谱可为研究分子微观结构、分子的构象特点及变化情况提供帮助。
1.2 荧光
1.2.1 荧光的产生
振动弛豫内转换S2振动弛豫振动弛豫系间窜跃S1T2T1内转换振动弛豫光吸收光吸收发射荧光发射磷光振动弛豫S0
图1-1 荧光的产生
如图1-1所示：当高能量光线照射荧光物质时，其分子或原子中的电子将吸收能量，由基态被激发到激发态。激发态有两种电子态：一种为激发单线态(S)，另一种为激发三线态(T)。电子处于高能级时不稳定，又会放出能量，从高能级跃迁回到低能级。当电子从最低激发单线态S1回到单线基态S0时会发射出光子，
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我们称之为荧光；当电子从最低激发单线态S1系间窜越到最低激发三线态T1，再从T1回到单线基态S0时发射出光子，我们称之为磷光[1]。
电子从基态跃迁到激发态吸收的能量要高于荧光发射的能量，则荧光探针的发射波长总是大于其激发波长,两者之差值称为斯托克斯(Stokes)位移。荧光分析就是利用Stokes位移将荧光染料的激发光与发射光分离开来,只检测发射光,从而提高检测的分辨率和灵敏度。
荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。这种技术的基本特点是具备高度灵敏性和极宽的动态时间响应范围，正是基于这种特点，该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。 1.2.2 荧光探针结构特点
只有含荧光基团的物质才有可能发射荧光。入射光照射时会产生荧光，而入射光一旦停止照射，荧光也几乎同时消失。荧光探针的激发光谱、发射光谱和荧光强度都与荧光基团的结构有密切的关系。
其结构有以下特点：(1)含有共轭双键体系, 通常增加分子内π电子共轭体系的长度可提高荧光效率并使荧光红移; (2) 具有芳环或杂环。芳环越大, 其荧光峰越向长波长方向移动, 荧光强度往往也越强。苯、萘仅在紫外区有荧光, 随着芳环的增加, 它们的荧光光谱可以进入可见光区; (3)具有刚性结构和平面结构的π电子共轭体系。闭环可以增加分子共平面性和刚性，从而使荧光增强。许多本身无荧光或者荧光很弱的化合物与金属鳌合产生具有环状结构的鳌合物时，会显示较强荧光。如图1-2所示，汞离子络合导致硫代罗丹明B酰肼开环荧光增强
[2]
。
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图1-2 硫代罗丹明B与汞离子络合
1.2.3 荧光探针传感机理
荧光分子探针是将至少两部分构件即受体结合部位和信号响应亚单位结合在一起的分子染料。化学传感器的一个重要特征就是能够将受体对被分析物的结合作出信号响应。大多数的被分析物自身并不具备信号发射团，因此设计一个荧光探针，就必须向体系中引入荧光团。最普遍也是最早使用的方法是将荧光团与受体共价连结在一起。除了上述共价结合发色团的方式以外，另一种方法是基于指示剂和被分析物对受体结合能力的不同。这种方法荧光团和受体并非共价结合，而是形成了分子自组装体。
信号单元识别单元被检物质+光照无荧光光照荧光
图1-3 荧光探针和荧光传感 1.2.4 常见荧光团
荧光团是荧光分子探针的最基本组成部分, 作用是将分子识别信息表达为荧光信号。荧光分子探针中的荧光团通过给出荧光强度的增强和减弱, 以及荧光峰值波长的位移等信息来反映微观世界的分子识别作用[3]。
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以蒽、芘为主要代表的稠环芳烃类荧光团一般都是具有强而稳定的荧光，在荧光分子探针研究领域里, 它们作为结构最简单的荧光团经常用于基础理论的研究。萘酰亚胺类化合物作为一种荧光团母核, 是很重要的有机功能染料中间体。此外，以吲哚环和苯并噻唑、苯并噁唑或苯并吲哚等含氮杂环为骨架的碳菁类荧光团近年来研究比较活跃。
ONOSHNNHHNNNSN
N
图1-4 蒽的衍生物，萘酰亚胺衍生物，苯并噻唑衍生物
香豆素、荧光素、罗丹明类分子等因具有较高的量子产率也常被用于制备荧光底物[4] 。香豆素母体结构无色且无荧光，取代后的香豆素衍生物可以产生绿色荧光。荧光素的量子产率高, 最大吸收/发射在492 /525 nm,大量的荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试剂。但荧光素衍生物也有如敏感性偏低、共轭体系不稳定、受环境因素影响较大等缺点。罗丹明类最大吸收/发射在496 /520 nm, 与荧光素类衍生物相比具有更强的光稳定性, 更高的荧光量子产率以及更低的pH 敏感性。由于目前没有合适的替代品，荧光素和罗丹明在生物医学领域内仍然是应用最为广泛的荧光团。
COOHCOOHNON+OO HOOO
图1-5 香豆素，荧光素，罗丹明B
卟啉和酞菁容易和不同金属离子反应形成多种配合物，具有较高的荧光量子
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产率和较大的Stokes位移。氟硼类荧光染料(BODIPY)类也具有结构稳定及量子产率高的特点。 1.2.5 荧光探针的性能 (1)Stokes位移
Stokes位移越大荧光探针检测越灵敏。 (2)荧光强度
荧光探针发射荧光的光量子数目为荧光强度，决定了荧光探针检测的灵敏度。
(3)荧光寿命
荧光寿命指分子在激发态的平均时间，即激发态寿命。不同性质的被测物可应用荧光寿命不同的荧光探针采取不同方法检测。 1.2.6 影响荧光探针性能的因素
合理的分子结构是影响荧光探针性能的首要因素。选择结构恰当的荧光探针检测不同结构的被测物，才能发挥荧光探针检测简便而迅速的优点。
刚性结构可增加荧光强度,若π电子共轭体系分子是刚性平面结构,分子则不易发生变形,而保持大的平面结构也就保持了大的π电子共轭度。同时荧光效率随着π电子共轭程度和分子平面度的增加而增大,其所发生的荧光光谱将向长波方向移动[5]。
荧光探针的取代基对其性能的影响非常大。推电子基团可以使荧光分子共轭体系增大，其荧光一般都会增强，如-OH、-OR、-NHR、-NR等。而吸电子基团的一般会使荧光减弱，如-C=O、-CHO、-COR、-COOH、-NO2、-N=N-等。卤素的取代称为重原子的取代，可以使荧光减弱而磷光增强。
此外还有一些环境因素也会对检测产生影响，如探针浓度、溶剂性质、pH值、温度等。 1.2.7 荧光淬灭
通过各种原因使荧光探针的荧光强度降低，导致荧光探针的浓度与荧光强度不呈线性关系的现象称为荧光淬灭。引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂。在使用荧光探针进行检测时，也应密切关注是否有淬灭剂存在及其对检测的影响。
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