（4）重组DNA导入受体细胞。
1．转化：是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其
获得新的表型的过程。
2．感染：λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，
在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
3．转染：转染是转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。常用方法有：电穿孔法、磷酸钙共沉淀法和脂质体融入法等。 （5）重组体的筛选。 1．遗传学方法 2．免疫学方法 3．核酸杂交法 4．PCR技术 5．酶切鉴定 （6）克隆基因的表达 137．真核细胞转染的方法：
（1）磷酸钙共沉淀法 (2) 电穿孔法
（3）DEAE－葡聚糖法 （4）脂质体介导基因转染 （5）显微注射法 138．重组DNA技术应用
（1）疾病基因的发现和克隆 （2）生物制药 （3）基因诊断 （4）基因治疗 （5）遗传病的预防
139. 细胞间信息物质（第一信使）：凡由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学
物质统称细胞间信息物质。包括：神经递质、内分泌激素、局部化学介质和气体信号。
140．细胞内信息物质：在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内化学物质。
141．第二信使：通常将Ca2+、cAMP、cGMP、DAG、IP3、Cer、花生四烯酸及其代谢产物这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使。
142．第三信使：负责细胞核内外信息传递的物质称为第三信使。是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白，能调节基因的转录，因此又称为DNA结合蛋白。 143．膜受体分为：环状受体、G蛋白偶联受体、单次跨膜α螺旋受体和具有鸟苷酸环化酶活性的受体。
144．胞内受体包括四个区域：高度可变区、DNA结合区、铰链区和激素结合区。 145．受体与配体结合的特点：高度专一性、高度亲和力、可饱和性、可逆性和特定的作用模式。
146．膜受体介导的信息转导途径 (1)cAMP－蛋白激酶途径。
1．cAMP的生成与降解。一些激素如肾上腺素、胰高血糖素等作用于相应的受体后，活化相应的受体，活化的受体可催化Gs的GDP与GTP交换，导致Gs的α亚基与βγ解离，释放出αs－GTP，αs－GTP可导致AC活化，使得ATP转变为cAMP，细胞内cAMP浓度升高。
cAMP在细胞内的浓度除与AC活性相关，还和磷酸二酯酶活性有关。 2．cAMP的作用机制。cAMP对细胞的调节作用是通过激活cAMP依赖性蛋白激酶系统来实现的。PKA是一种由四聚体组成的别构酶（C2R2）.其中C为催化亚基，R为调节亚基。每个调节亚基上有两个cAMP结合位点，催化亚基有催化底物蛋白质特定丝/苏氨酸残基磷酸化的功能。调节亚基与催化亚基结合时，PKA呈无活性状态。当4分子cAMP与两分子调节亚基结合后，调节亚基脱落，游离的催化亚基具有蛋白激酶活性。
3．PKA的作用。PKA被cAMP激活后，能在ATP存在的情况下使许多蛋白质特定的丝/苏氨酸残基磷酸化，从而调节细胞的物质代谢和基因表达。
对代谢的调节作用：肾上腺素调节糖原分解的级联反应。肾上腺素与质膜上的受
体结合后，通过激动型G蛋白使AC活化，AC激活ATP生成cAMP。后者进一步激活PKA，PKA一方面使无活性的磷酸化酶激酶b磷酸化为有活性的磷酸化酶激酶b，后者能催化磷酸化酶b成为有活性的磷酸化酶a. 磷酸化酶a经磷蛋白磷酸酶脱去磷酸又转变为无活性的磷酸化酶b。磷蛋白磷酸酶活性也受PKA的调节。同时，PKA也使有活性的糖原合酶的特定丝/苏氨酸残基磷酸化转变成无活性。
对基因表达的调节作用:在基因的转录调控区有一类cAMP应答元件（CRE），它可与cAMP应大元件结合蛋白（CREB）相互作用而调节此基因的转录。当PKA的催化亚基进入细胞核后，可催化反式作用因子－CREB中特定的丝/苏氨酸残基磷酸化。磷酸化的CREB与DNA上的CRE结合，从而激活受CRE调控的基因转录。
（2）Ca2+-依赖性蛋白激酶途径 1．Ca2+-磷脂依赖性蛋白激酶途径
IP3和DAG的生物合成和功能：去甲肾上腺素等激素作用于靶细胞膜上相应的受体后，通过Gp激活PI-PLC，后者可水解PIP2而生成DAG和IP3。DAG生成后仍留在质膜上，在磷脂酰丝氨酸和Ca2+的配合下激活PKC。IP3生成后，从膜中扩散到胞浆中与内质网和肌浆网上的受体结合，促进这些钙储存库内Ca2+ 的释放，Ca2+能与胞浆内的PKC结合并聚集到质膜，在DAG和膜磷脂共同诱导下，PKC被激活。
PKC的生理功能：对代谢的调节作用和对基因表达的调节作用。 2．Ca2+-钙调蛋白依赖性途径
钙调蛋白为钙结合蛋白，人体的CaM有4个Ca2+结合位点，这些位点被占满后其构象发生改变。当胞浆内Ca2+浓度高到10-2mmol/L时，Ca2+与CaM结合。Ca2+－CaM底物谱很广，可以磷酸化许多蛋白质的丝/苏氨酸残基，使之激活或失活。Ca2+－CaM既可以激活腺苷酸环化酶又可以激活磷酸二酯酶，使它既加速cAMP的生成又加速cAMP的讲解，使信息迅速传到细胞内，又迅速消失。Ca2+－CaM在细胞的信号传递中也起着重要作用。 （3）cGMP-蛋白激酶系统
cGMP由GTP在鸟苷酸环化酶的催化下生成，经磷酸二酯酶催化而降解。心钠
素（ANP）与靶细胞膜上具有鸟苷酸环化酶活性的受体结合后，能激活鸟苷酸环化酶，后者催化GTP转变为cGMP。cGMP能激活cGMP依赖性蛋白激酶G（PKG），催化有关蛋白丝/苏氨酸残基磷酸化，产生生物学效应，即松弛血管平滑肌和增加尿钠，还可以降低血压。 （4）酪氨酸蛋白激酶体系
1．受体型TPK-Ras-MAPK途径：受体与配体结合后，发生自身磷酸化和磷酸化GRB2和SOS。磷酸化的受体与GRB2－SOS复合物结合，进而激活Ras蛋白。Ras蛋白又称小G蛋白，性质类似与G蛋白中的Gα亚基，它的活性和其结合GTP或GDP直接有关，Ras与GDP结合时无活性，与GTP结合而活化。活化的Ras蛋白可进一步活化Raf蛋白。Raf蛋白具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，它可进一步激活有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）系统。MAPK系统包括MAPK、MAPKK、MAPKKK，MAPK更具广泛的催化活性，它既能催化丝/苏氨酸残基又能催化酪氨酸残基磷酸化，故是具双重催化活性的蛋白激酶。MAPK除调节花生四烯酸代谢和细胞微管形成外，更重要的是可催化细胞核内许多反式作用因子的丝/苏氨酸残基磷酸化，导致基因转录或关闭。受体型TPK活化后还可通过激活AC，多种磷脂酶等发挥调控基因的作用。 2．JAKs-STAT途径
一部分生长因子和大部分细胞因子可借助细胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶JAKs完成信息传导。JAKs再通过激活STAT影响基因的转录调节。 （5）核因子κB途径
主要涉及机体的防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。 （6）TGF-β途径
调节增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞反应。 147.双脱氧链终止法测序的基本原理：
和模版互补结合的引物在DNA聚合酶（通常是DNA聚合酶I的大片段Klenow或T7DNA聚合酶）作用下发生互补链的延伸反应，反应体系中的2’-3’-双脱氧链核苷三磷酸(ddNTP)与底物脱氧核苷三磷酸(dNTP)竞争结合与延伸互补链末端，造成延伸终止。由于产生一系列分别终止于A、G、T、C位置的不同大小
的DNA末端，应用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨仅相差一个核苷酸的20－500碱基的DNA片段，结合放射自显影技术，便可直接读出模板DNA的待测序列。
148．化学裂解法测序原理：
采用化学试剂处理末端放射性标记的DNA单链片段，造成碱基非特异性切割，由此产生一组具不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测DNA的核苷酸顺序。
149．大片段DNA序列测定的策略：随机法、嵌套缺失法、引物延伸法。 150．核酸分子杂交：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
151．核酸分子杂交的原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针，探针通常用于进行核素或非核素标记。
152．DNA变性：在物理或化学因素作用下，，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中所有的共价键不受影响，称为DNA变性。 153．导致DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性。 153. Tm值：双链DNA变性一半所需要的温度称作DNA的溶解温度。 154．复性：两条互补的单链DNA分子在变性条件除去后能重新按碱基互补配对原则以氢键相连形成双链DNA分子，这一过程称为DNA复性。 155．影响杂交的因素： 1．核酸分子的浓度和长度 2．温度 3．离子强度 4．杂交液中的甲酰胺 5．核酸分子的复杂性 6．非特异性杂交反应
156．FISH(荧光原位杂交)：是一种非放射性原位杂交方法，用特殊荧光标记核