酸探针，可在染色体、细胞和组织切片上进行DNA杂交，能够非常有效地检测细胞内是否存在特定的DNA或RNA序列。 157．Southern Blotting步骤：
1．待测核酸样品的制备。包括制备待测DNA和DNA的限制酶消化。 2．待测DNA样品的电泳分离。 3．凝胶中核酸的变性。
4．Southern转膜。常用的转膜方法：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空 转移法。
5．探针的制备
6．Southern杂交。必须先进行预杂交。 7．杂交结果的检测。
158：预杂交：能够结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。 159．Southern Blotting：是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合与一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。
160．Northern Blotting:是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固－液相杂交，检测RNA（主要是mRNA）的方法。
161．斑点印迹：将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹（Dot Blot）. 162. 原位杂交：核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 163．原位杂交的步骤： 1．组织或细胞的固定
2．组织细胞杂交前的预处理。一般用去垢剂（Triton X－100、SDS）或蛋白酶消化。
3．探针的选择和标记 4．杂交
5．杂交结果检测
164．液相杂交：是指待测核酸分子与核酸探针都存在与杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子，常用的液相杂交有RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。
165．RNA酶保护分析法：是利用RnaseA和RnaseT1能专一性降解单链RNA而双链RNA则受到保护的特点，用放射性标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体。此法用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。RPA的基本程序： 1．制备待测RNA 2．RNA探针的标记 3．杂交
4．除去单链RNA 5．电泳分析
166．探针的种类：cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针 167．标记物：
（1）核素标记物：32P、35S等，以32P最常用。
（2）非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针。 168．标记方法：缺口平移法、随机引物法、PCR法、末端标记法
169．探针的纯化方法：乙醇沉淀法、Sephadex G-50柱层析法、微柱离心法 170．缺口平移法原理：利用适当浓度的DNaseI在DNA双链上随即切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5’端和一个3’端，3’端即可作为引物，在DNA聚合酶I的5’-3’DNA聚合酶活性催化下，以互补的DNA单链为模版，依次将dNTP结合到切口的3’端，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性在切口处将旧链从5’逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。
171．随机引物法原理：随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析了生物基因组DNA六核苷酸排列的多种可能性而设计的。对于任意一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物都有一些核苷酸片段与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些随机引
物与变性后的DNA单链结合，然后以此结合的随机引物为引物，以变性后的单链DNA为模版，在Klenow酶的催化下，以四种dNTP（其中一种为标记物标记的DNA探针）为底物，合成与探针互补的且带有标记物的DNA探针。 172．PCR的原理：
PCR是一种体外扩增DNA的技术，基本原理是：作为引物的一对寡核苷酸与模板DNA同源序列按照碱基互补配对原则形成局部双链，然后在Taq DNA聚合酶作用下引导新链DNA的合成，一般经25－30个变性、退火、延伸的循环，可以获得特异性PCR产物。PCR反应体系包括：耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡核苷酸引物、4种dNTP、合适的缓冲液体系、模板DNA。 173．引物设计的原则：
1．引物长度一般为15－30个核苷酸 2．两个引物之间不应该存在互补序列 3．引物本身不应存在互补序列
4．引物与非特异性扩增区序列的同源性不应超过70％，引物的3’端连续8个碱基在待扩增区外不应有互补序列
5．引物的5’端最多可以游离10几个碱基而不影响反应的进行
6．引物碱基组成应随机分布，应避免嘌呤或嘧啶的堆积，特别是引物的3’端不应有连续3个G和C。
7．引物的3’端一定要与模版配对。
174．PCR到达平台期所需PCR循环次数取决于：样品模版的拷贝数、PCR的扩增效率以及DNA聚合酶的种类和活性，以及非特异性产物的竞争。到达平台期前，一般要进行25次以上的循环。 175．PCR反应注意事项：
1．隔离不同操作区，包括样品制备区、PCR操作区和反应产物分析区 2．严格实验操作
3．设立实验对照：阳性对照、阴性对照、试剂对照
176．筑巢PCR：先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用一对内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特异性。
177．多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。由于每对引物扩增区位于模板DNA的不同部位，因而扩增片段长短不同。由此检测是否存在某些基因片段的缺失或突变。
178．共享引物PCR：是利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物。这种PCR方法常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
179．原位PCR:以组织固定处理细胞内的DNA或RNA为靶序列，进行PCR反应的过程，称为原位PCR。原位PCR不需从组织细胞中分离模板DNA或RNA。原位PCR成为靶基因序列的细胞定位、组织分布和靶基因表达检测的重要手段。
180．RT－PCR：是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。首先用RNA为模板，在反转录酶作用下合成cDNA，再以cDNA为模版通过PCR反应来扩增目的基因。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性定量分析的最有效方法之一。
181．实时PCR（Real time PCR）: Real time PCR的基本原理是引入了荧光标记分子，使得在PCR反应中产生的荧光信号与PCR产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出PCR模版DNA的含量。探针的5’端有一个荧光报告分子，3’端有一个荧光淬灭分子。没有扩增反应时，探针保持完整，无荧光信号释放。随着PCR的进行，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的荧光探针，其5’-3’外切核酸酶就会将该探针逐步切断，报告荧光基团一旦与淬灭基团分离，便产生荧光信号。后者被荧光检测系统接收，用于数据分析。
182．基因组DNA文库的构建：
基因组DNA文库是指包含某一个生物细胞全部基因组DNA序列的克隆群体，它以DNA片段的形式贮存着某一生物的全部基因组DNA信息。
基因组DNA文库的构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用适当的限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到噬菌体载体中，从而获得一群含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组DNA文库。 183．cDNA文库及构建：
cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。
cDNA文库的构建：将组织细胞中的mRNA经过反转录合成从cDNA，后者被克隆进入质粒或噬菌体载体，转化宿主细胞后可获得克隆群体。
184.转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
185．导入基因的主要方式：显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法。 186．基因打靶的必备条件：胚胎干细胞、打靶载体
187．打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
188．基因敲除的基本程序： 1．打靶载体的构建 2．打靶载体导入ES细胞 3．基因敲除ES细胞注射入胚泡 4．胚泡植入假孕小鼠的子宫中 5．嵌合体的杂交育种
189．构建打靶载体的基本过程
1．获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中 2．从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端
3．将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间
4．在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中
190．DNA芯片技术：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。