设计实验 >> 1. 细胞概述
1. Miller证明地球上的有机分子自动合成的装置(图E1-1)（答案）
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答: Miller推测,大气层中含有甲烷和氨,也含有氢和水蒸气。他把这些气体一起放入实验装置中（图E1-1）,然后一直与电火花接触,在这一装置中靠沸水提供水蒸气。反应一个星期后分析产物。令人惊讶的是,产物中有大量的有机物,包括尿素、生物和非生物的氨基酸等, 实验证明了在雷电作用下能够利用大气中的分子合成有机分子。也就是说在进化的某一过程中地球上有了构成细胞生命物质的基本元件:氨基酸、碱基、单糖等,为细胞的起源作好了物质准备。
图E1-1 Miller证明地球上的有机分子自动合成的装置
设计实验 >> 2.细胞生物学研究方法
1. 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明的单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)的实验原理和技术细节有哪些?（答案）
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答:1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术,因此获得1984年诺贝
尔医学奖。它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术，其原理是: B淋巴细胞能够产生抗体, 但在体外不能无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性, 既能产生抗体,又能无限增殖。
图E2-1所示是单克隆抗体制备流程。首先用一种抗原注射小鼠，引起产生特异抗体的细胞大量增殖,取出小鼠的脾,分离产生抗体的淋巴细胞，同骨髓瘤细胞进行融合，在HAT培养基上进行初步筛选后，经过进一步鉴定,得到生产单克隆抗体的细胞。
图E2-1 单克隆抗体技术
筛选用的HAT培养基是选择性培养基，含有氨基喋呤(aminopterin,A)、次黄嘌呤(hypoxanthine,H) 和胸腺嘧啶(thymidine,T)。在HAT培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡。因为，正常的未融合细胞具有核酸合成主要通路和旁路所必需的
酶但不能在体外长期生长；突变后的肿瘤细胞只具有 RNA和 DNA合成所必需的主通路的酶，而缺乏利用胸腺嘧啶核苷合成 DNA的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或缺乏利用次黄嘌呤合成 RNA的磷酸核糖转移酶(HGPRT)。当这些细胞的核酸合成主通路被培养基中氨基喋呤阻断后，则因核酸合成障碍而死亡。只有肿瘤细胞和具有合成旁路酶的正常细胞形成的融合细胞，才能在氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下利用其中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核酸而得以生存。由于融合细胞具有肿瘤细胞和抗体分泌细胞双重特征，所以在去除氨基喋呤这一核酸阻断剂后即可在正常培养基中长期传代增殖，并分泌抗体。在 HAT培养基中生存下来的细胞，可以是各种正常细胞与瘤细胞的融合体，还可能是多克隆杂交瘤细胞的混合群体，因此须进一步用稀释法分离出单克隆的杂交瘤细胞和筛选出识别特异性抗原的抗体分泌克隆，才能最终得到特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。
设计实验 >> 3. 细胞质膜与跨膜运输
1. Irving Langmuir如何通过实验提出脂单层的设想？这一设想对膜结构的研究有何特长意义？（答案）
答:关于细胞质膜膜的化学组成和结构，Irving Langmuir通过展层实验，提出脂单层(lipid monolayer)的设想。他将提取的膜脂铺展在Langmuir 水盘(Langmuir Trough)的水面上,研究了脂的展层行为,发现脂在水面上形成一薄层。他用苯将脂溶解,然后将苯-脂溶液放在水面上展层,当苯挥发后,留下的脂在水面上形成单脂层(图E3-1),亲水的头朝向水面,疏水尾背离水面。脂单层概念是20世纪初膜结构研究的基础,导致后来脂双层的发现。
图E3-1 脂在Langmuir 水盘中展现单脂层
水盘有一个浅盘和一个可移动的挡板组成。移动挡板可将磷脂单层向固定挡板端挤压,形成致密的单脂层。
1925年两位荷兰科学家E.Gorter和F.Grendel根据对红细胞质膜的研究首次提出质膜的基本结构是双脂分子层。他们看到了Langmuir的研究论文,认为可以用展层方法研究红细胞
膜脂的结构,因为Overton已经提出在细胞的外层有脂的包被,推测红细胞的表面也有脂的存在。在红细胞的外侧包被中有多少脂? 尚不清楚。但是,他们在显微镜下观察到人的红细胞是扁平状,直径约为7μm。根据红细胞的体积,推测红细胞的表面积约为100μm2。他们分离纯化了红细胞,并从一定数量的红细胞中抽提脂类,按Langmuir的方法进行展层,并比较展层后脂单层的面积和根据体积所推算的总面积。比较的结果, Gorter和Grendel发现脂铺展的面积同实际测量的红细胞的表面积之比约为1.8～2.2∶1，为了解释这一结果，他们提出红细胞膜的基本结构是脂双层(lipid bilayer)。同时，推测脂双层具有热力学的特点,认为极性的亲水基团朝向外侧的水性环境。他们的实验和依据实验所得出的结论具有非常重要的意义,这是人类第一次从分子水平研究细胞膜的结构。
2. 细胞膜上有很多蛋白,如何鉴定膜运输蛋白?（答案）
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答:目前有两种鉴定方法(图E3-2),一种是亲和标记法(affinity labeling),另一种是膜重建(membrane reconstitution)。
图E3-2 鉴定膜运输蛋白的两种方法
上:亲和标记法,在此法中常常用到特异的运输系统的抑制剂。下:膜重建法。
在亲和标记法中,主要是用放射性标记的分子抑制某种物质的运输.这种抑制作用是由抑制剂同膜运输蛋白的结合引起的,然后分离膜蛋白,鉴定同抑制剂结合的膜蛋白。例如细胞松弛素B是葡萄糖运输蛋白的抑制剂,因此将放射性标记的细胞松弛素加入到细胞液中,就可同膜中葡萄糖运输蛋白结合,然后从膜中分离蛋白,通过放射性分析鉴定膜运输蛋白。在膜重建法中,首先要分离纯化膜蛋白,然后将分离纯化的蛋白质同磷脂混合,构建人工脂质体，然后检测脂质体的运输能力。
3. 请设计一种方法检测跨膜蛋白的哪一部分位于膜的外侧,哪一部分位于膜的内侧? （答案）
答:① 用相对分子质量大而不能透过细胞质膜的胰蛋白酶处理胰蛋白酶完整的细胞: 这种处理可以将跨膜蛋白的朝向外侧的肽水解,而位于脂双层和细胞质面的部分则不受影响。
② 用非离子去垢剂或渗透休克提高膜的渗透性,让膜失去了对蛋白水解酶渗透的障碍作用, 结果使膜蛋白的细胞质部分被蛋白酶水解。
处理的结果可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。同时设置对照细胞。 实验过程示于图E3-3。
图E3-3 测定膜蛋白在膜中定位的实验过程
设计实验 >> 4. 细胞环境与互作
1. 证明细胞具有识别能力的经典实验是什么?（答案）
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