图9E-4 无细胞体系证明高尔基体中间膜囊在蛋白质转运中的作用
5. 你了解溶酶体的发现过程吗?（答案）
答:在二十世纪的五十年代初期，Christian de Duve 和他的同事在研究亚细胞组分时发现了溶酶体，不过，溶酶体的发现带有很大的偶然性。
de Duve 对胰岛素在碳水化合物代谢中的作用很感兴趣, 他打算通过对葡糖-6-磷酸酶在细胞内的定位来研究胰岛素对碳水化合物代谢的影响, 该酶在细胞内的作用是向血液中释放葡萄糖。
在试验中，他们选用酸性磷酸酶作为对照，因为酸性磷酸酶并不参与碳水化合物的代谢。他们先用0.25M的蔗糖对肝组织进行匀浆，然后用差速离心分离细胞组分。实验中发现葡糖-6-磷酸酶总是与微粒体在一起被分离。这一发现非常重要，因为当时人们普遍认为微粒体就是破碎的线粒体囊泡，由于葡糖-6-磷酸酶只与微粒体相关, 并不与线粒体一起被分离, 这就有理由推测, 微粒体是不同于线粒体的细胞结构。
另一方面，他们发现虽然在离心分离的线粒体组分中酸性磷酸酶的浓度最高，但也只占
肝细胞中酸性磷酸酶总量的10%, 还有90%的酸性磷酸酶在离心分离过程中是如何分部的并不了解。当时他并没有重新分析实验结果，因为时间太晚了,于是将样品放在低温下冷藏起来。可是，几天后当他重新分析分离样品的酸性磷酸酶时，发现活性比原来高出了10倍。于是 de Duve 推测∶某些酸性磷酸酶在分离的线粒体组分中可能被\隐藏\了，在冷藏过程中酸性磷酸酶被某种因素激活。于是他对冷藏的线粒体分离样品重新离心，将线粒体沉淀后分析上清液中酸性磷酸酶的活性，发现上清液中的酸性磷酸酶的活性提高了，这就是说,冷藏后酸性磷酸酶活性的提高主要是由于可溶性的酸性磷酸酶量的增加。
虽然这一发现与de Duve原来的研究目的无关，但是他决定继续研究下去，因为他意识到这种发现有某种重要性。他很快发现除了冷藏之外还有其它的一些处理也可以提高酸性磷酸酶的活性。他们发现在样品匀浆过程中，通过冷冻、加热、添加去垢剂等都能够提高肝组织匀浆液中酸性磷酸酶的活性。由于所采取的措施都是促进膜的破裂, 于是推测∶酸性磷酸酶位于膜结合的细胞器中，因为他们用于分析酸性磷酸酶活性的底物都是不能通过扩散穿过膜的双脂层, 只有膜破裂之后待酸性磷酸酶释放到溶液中才能测到酶的活性(图9E-5)。
图9E-5 酸性磷酸酶存在于膜结合小泡中的实验证明
左:造成膜泡破裂及酸性磷酸酶释放的条件; 右: 将鼠肝的线粒体分离组分置于低渗条
件下, 检测的酸性磷酸酶的活性曲线。
细胞内有很多种膜结合细胞器，酸性磷酸酶到底存在于何种膜结合细胞器中? de Duve 原先将酸性磷酸酶定位在线粒体中，后来在一次偶然的实验中，否定了这一假设。他的一位学生在离心分离线粒体时，并没有用超速离心而是用了较低的速度，这种较低速度的离心同样分离到大量的线粒体组分，但是在收集的线粒体组分中没有可检测的酸性磷酸酶的活性。这种偶然的发现导致de Duve相信酸性磷酸酶位于其它的膜结合细胞器中。
为了验证这一想法，他重新设计了分离线粒体的离心分离方法，按照原先的方法分离线粒体组分后，再调整离心速度重新进行离心分离，得到大小两部分(fraction)，发现与线粒体
功能有关的酶,如细胞色素氧化酶, 存在于大的部分中，而酸性磷酸酶和另一些水解酶类(核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶)一起存在于小的部分中, 由于这5种酶都是小分子的水解酶, 于是de Duve认为大的部分是真正纯化的线粒体，而小的部分在细胞内行使消化作用，1955年他将这一部分命名为溶酶体。需要说明的是，de Duve发现的只是生化证据，并没有看到真正的溶酶体，在电子显微镜下观察到溶酶体是后来的事。
设计实验 >> 10. 细胞骨架与细胞运动
1. 关于细胞运动中力产生的两种假说的主要内容是什么? 如何证明肌球蛋白在细胞运动中的作用?（答案）
答: 细胞运动中力的产生有两种假说是微丝装配假说和滑动假说。
第一种假说的主要内容是:肌动蛋白亚基从微管的周质一端添加到肌动蛋白纤维中, 这样迫使细胞向前伸展。第二种假说的核心内容是: 细胞的伸展是通过肌球蛋白与相邻细胞周质肌动蛋白纤维相互作用将细胞向前推进, 而靠近细胞质中间部分的肌动蛋白纤维则不能同肌球蛋白接触。这两种假说对于肌动蛋白的作用是肯定的, 但是对于肌球蛋白来说, 却不能肯定。
为了检查肌球蛋白在细胞蠕动中的作用, 用荧光标记的抗不同肌球蛋白的抗体注射迁徙细胞, 然后通过荧光分析。结果表明, 肌球蛋白Ⅰ位于蠕动细胞的前部, 而肌球蛋白Ⅱ在蠕动细胞的尾部。根据这一结果, 推测肌球蛋白Ⅰ是细胞蠕动的主要马达分子, 而肌球蛋白Ⅱ可能帮助细胞与基质脱离并推动细胞前进。
2. 大多数动物细胞基本上是球形的，但也有细胞具有不对称结构, 如何证明不对称结构与肌动蛋白的作用相关?（答案）
答: 大多数细胞是球形的, 原因是动物细胞具有流动的细胞质和具有韧性的细胞质膜。但是，有些细胞具有高度不对称的形态，这种形态的形成需要肌动蛋白纤维的作用。因为肌动蛋白纤维能够成束，这样就会使细胞的某一部分向外突出，形成不对称结构。为了证明这一点, 只要用作用于肌动蛋白的药物处理细胞, 如用细胞松弛素处理具有不对称形态的细胞, 如果细胞变成圆形, 说明肌动蛋白束在维持细胞的形态方面具有重要作用。
3. 请设计实验研究肌动蛋白纤维装配的过程（答案）
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答: 第一个过程是成核作用(nucleation), G-肌动蛋白慢慢地聚合形成短的、不稳定的寡聚体，该过程较慢。一旦寡聚体达到某一种长度(约3～4个亚基)，它就可以作为“种子”，或者“核”，进入第二个过程∶快速延长阶段。在延长阶段，G-肌动蛋白单体快速地从短纤维的
两端添加上去。生长期可被已形成的F-肌动蛋白的自发或突然断裂作用所加强，因为断裂的短F-肌动蛋白纤维的末端可以作为新的核进行延长反应。可以在反应体系中添加小的F-肌动蛋白纤维缩短成核期，或除去成核作用。随着F-肌动蛋白的不断生长，游离的G-肌动蛋白单体的浓度越来越低，一直到同F-肌动蛋白纤维的浓度相平衡。一旦达到这种平衡，F-肌动蛋白的装配进入第三阶段∶稳定期(steady state)。之所以称为稳定期，是因为在这个时期，G-肌动蛋白同F-肌动蛋白纤维末端上的亚基进行交换，但不改变F-肌动蛋白纤维的量。
设计实验 >> 11. 细胞核与染色体
1. 1965年，Ccarl Feldherr通过什么实验证明了核孔的运输作用?（答案）
答: 1965年，Ccarl Feldherr 将各种不同大小的金颗粒注射到变形虫的细胞质中，然后检查这些颗粒进入细胞核的情况，发现∶小的金颗粒很快进入了细胞核，但体积越大进入的速度就越慢，大于10nm的金颗粒就进不了细胞核，由此推测∶核孔可作为水性的运输通道，允许小分子的物质自由扩散出入细胞核(图E11-1)。
图E11-1 核孔的运输作用
2. 在生理状态下, 细胞核RNA的输出可能是一种具有高度选择性的信号指导的过程。在RNA聚合酶Ⅱ指导下合成的RNA(mRNA和snRNA), 当其5'端具有m7 GpppG帽子结构时, 即被定位于细胞质, 而没有帽子结构的snRNA则定位在细胞核。如何证明m7 GpppG帽子结构具有核输出的信号作用?（答案）
答: 将游离的具有帽子结构的类似物m3 GpppG二核苷酸向核内进行连续注射, 发现可抑制新转录的具有m7 G帽子的U1snRNA的核输出；而注入m7 GpppG却没有这种效应, 说明5'端m7 G帽子结构对于mRNA及U1snRNA的核输出是关键信号。这种现象称作帽结合活性(cap binding activity, CBA)。在细胞核中由RNA聚合酶Ⅱ合成的U1，U2，U4和U5 snRNA在合成之后立即在5' 端加上m7G的帽子结构，然后这些加工过的snRNA被运输到细胞质中同相应的蛋白质组装成snRNPs,再运回到细胞核参与RNA的剪接。在细胞核中snRNA须进一步甲基化成m2,2,7G。但是，由RNA聚合酶Ⅲ合成的U6snRNA的5＇端没有m7G的帽子结构，只有一个三磷酸核苷，所以它不会被运送到细胞质中。后来有人将RNA聚合酶Ⅲ的启动子同U1snRNA连接起来，转录成的U1 snRNA也不能被运送到细胞质(图E11-2)。
图E11-2 U1snRNA从细胞核向细胞质运输需要5ˊ帽子结构的试验证明
3. 核定位信号与核蛋白的输入最早是通过核质蛋白(nucleoplasmin)的注射实验发现的。这一实验是如何进行的? 结论是什么? （答案）
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答: 核质蛋白是一种丰富的亲核蛋白, 具有头尾两个不同的结构域，由5个单体组成, 相对分子质量为165kDa, 是耐热性可溶蛋白。
首先对核质蛋白进行标记, 然后用蛋白酶对核质蛋白进行有限的消化, 分离纯化头部和尾部。将具有标记的完整的核质蛋白、头部、尾部以及用 胶体金包裹的尾部分别注射到非洲爪蟾的卵母细胞质中。温育后分离细胞核和细胞质进行放射性检测分析。结果表明:完整的单独的未被包裹的尾部能够进行细胞核, 其它则不能。这一实验结果说明尾部具有核定位信号, 并且只要有一个尾部结构, 就可将全部的头部带入细胞核(图E11-3)。
图E11-3 核质蛋白输入细胞核的实验