答: 首先用温和法分离纯化含有CF1CF0的类囊体小泡, 将分离的类囊体置于pH7.5 的溶液中平衡后,再于暗处置于pH4.0的溶液中,使类囊体小泡膜内外的pH平衡(pH达到4,0),最后将类囊体小泡置于含有ADP和Pi的溶液中,测定ATP的合成,及H+质子从类囊体小泡中输出。流程如图8E-2。
图8E-2 CF1利用人工pH梯度合成ATP
3. 什么是卡尔文循环? 是如何发现的(实验要点)?（答案）
答: 卡尔文通过实验发现的CO2在光合作用中被固定的一种途径, 由于这一途径中CO2的固定是一个循环过程, 并且是卡尔文发现的, 故称为卡尔文循环。
二次世界大战之后,美国加州大学贝克利分校的 Melvin Calvin和他的同事们使用踪和双向纸层析技术,研究一种藻:Chlorella在光合作用中怎样固定CO2,。
他们将培养的藻生长在含有未标记CO2的密闭容器中,然后将标记的CO2注入培养基,培养合适时间后,将培养的藻浸入热的乙醇中,这种处理有三种功效:杀死细胞、终止酶的作用、提取溶解的分子。然后将提取物点在层析纸上进行双向纸层析,最后通过放射自显影分析放
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C示
射性斑点,并同已知化学成份进行比较。
在卡尔文的实验中,发现标记的CO2转变成有机物的速度很快,几秒钟之内,在层析纸上就有放射性的斑点,经测定,斑点中的化学成份是三磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate,PGA),是糖酵解的中间体。由于被鉴定到的第一个中间体是三碳分子, 所以将CO2的这种固定途径称为C3途径,将通过这种途径固定CO2的植物称为C3植物。最终的研究结果发现, CO2固定的C3途径是一个循环过程,称为C3循环,由于这一循环是卡尔文发现的,故又称卡尔文循环,可分为三个阶段: 羧化、还原和RuBP的再生。
设计实验 >> 9. 内膜系统与膜运输
1. Jamws Jamieson 和George Palade是如何用同位素示踪技术研究胰泡细胞中蛋白质分泌的?（答案）
答: 胰腺系统中胰泡细胞具有最发达的内膜系统, 主要功能是合成消化酶类。这些酶类合成之后要从胰腺系统经由导管分泌到小肠中行使功能。这些酶是如何分泌出去的? Jamws Jamieson 和George Palade使用放射自显影技术得到了答案。
他们将一小块胰腺组织放在加有放射性同位素标记氨基酸的培养液中进行短暂培养，在此期间,活细胞就会摄取具有放射性的氨基酸并掺入到核糖体合成的消化酶中,然后立即将组织进行固定,通过切片和放射自显影检测,发现放射性出现在内质网,说明蛋白质的合成始于内质网。为了检查蛋白质合成后的运输路线,他们还进行了一系列脉冲追踪实验
(pulse-chase experiment), 即将组织置于加有放射性同位素标记氨基酸的培养液中进行短暂培养，然后将组织洗净再置于无同位素的培养基中培养不同时间再进行组织固定和放射自显影术检测。检测的结果表明∶追踪培养的时间越长，同位素标记的蛋白离开合成部位越远,分泌蛋白在内质网合成后转移到经高尔基体,再转移到分泌小泡和细胞外(图E9-1)。
图E9-1 蛋白质分泌的同位素示踪实验示意图
(a)细胞与同位素接触3分钟之后,标记物出现在内质网中; (b)细胞接触同位素3分钟后,
置于非同位素的培养基中“跟踪”17分钟,放射性标记出现在高尔基体和部分分泌泡; (c)细胞接触同位素3分钟后,置于无同位素的培养基中“跟踪”117分钟,标记物主要出现在分泌泡中。
2. 如何利用利用微粒体在无细胞蛋白质合成系统中的合成实验证明膜结合核糖体合成的蛋白质进入了微粒体的腔。（答案）
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答: 实验设计要考虑三个问题: ①分离有功能的结合有核糖体的微粒体;②要用同位素标记新合成的蛋白质; ③要能使蛋白质合成提前终止,防止成熟之后被降解。
二十世纪六十年代,Colvin Redman 和 David Sabatini用分离的RER小泡研究膜结合核糖体合成的蛋白质是否会进入RER的腔, 他们的实验要点是:
将RER微粒体置于加有放射性标记氨基酸的蛋白质合成体系中进行短暂温育,然后加入嘌呤霉素，使蛋白质合成提前中止并从核糖体中释放出不完全的多肽。此时离心收集RER小泡,用去垢剂将RER小泡破坏,使小泡内的物质释放出来,并对其进行分析,结果表明,从破裂的RER小泡中释放出来的物质中有放射性标记的新合成的多肽(图9E-2)。
图9E-2 证明膜结合核糖体合成的蛋白质进入RER腔的实验
3. 请你设计一个离体实验证明SRP和SRP受体的功能。（答案）
答: 实验中首先要分离SRP、SRP受体和微粒体, 并要有克隆的分泌蛋白的基因, 然后在无细胞蛋白质合成系统中进行蛋白质合成实验。主要做法是:
在无细胞翻译体系中如果不加SRP、SRP受体、微粒体，分泌蛋白只能合成一条带有信号序列的完整多肽；如果加入SRP、但不加入SRP受体和微粒体，新生肽的合成在完成70-100个氨基酸时被阻断,因为SRP已经与信号序列结合并中止了蛋白质的翻译,但由于找不到受
体,SRP不能被释放,所以蛋白质不能继续合成；如果反应体系中加有SRP和SRP受体,但没有微粒体，也能够合成完整的具有信号序列的多肽，并且会伴随GTP的水解而释放出SRP颗粒。如果在反应体系中同时加有SRP、SRP受体和微粒体，将会合成一条成熟的没有信号序列的多肽，并且释放到微粒体中(图9E-3)。
图9E-3 SRP、SRP受体和微粒体在分泌蛋白共翻译转运中的作用。
4. James Rothman 和Lelio Orci怎样通过实验证明高尔基体的中间膜囊具有蛋白质转运和加工的作用?（答案）
答: 他们首先对培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO)进行诱变,获得一个突变体,该突变体是N-乙酰葡萄糖胺转移酶缺陷。在正常细胞中,该酶存在于高尔基体的中间膜囊, 可将UDP-N-乙酰葡萄糖胺中的N-乙酰葡萄糖胺转移到糖蛋白的甘露糖上。
实验中还要用一种病毒:水泡病毒(vesicular stomatitis virus,VSV),VSV病毒是一种病原体,它能够编码一种膜整合糖蛋白(VSV-G),这种蛋白的糖基化是在高尔基体的中间膜囊中由N-乙酰葡萄糖胺转移酶催化的。
先用VSV感染突变的CHO细胞,培养后分离感染细胞的高尔基体, 同时分离野生型、未经病毒感染的CHO细胞高尔基体。生化分析表明, 从野生型CHO细胞中分离的高尔基体中间膜囊中没有VSV-G蛋白,而从感染的突变体CHO细胞中分离的高尔基体中间膜囊中有VSV-G蛋白,但是在甘露糖残基上没有N-乙酰葡萄糖胺。
他们将野生型CHO高尔基体作为VSV-G蛋白受体.病毒感染的CHO高尔基体作为VSV-G蛋白供体进行混合,同时添加小泡形成和转移所需的因子,以及放射性标记的N-乙酰葡萄糖胺。温育一段时间后再进行分析,发现高尔基体中间膜囊中已有被放射性标记的N-乙酰葡萄糖胺修饰的VSV-G蛋白(图9E-4),这一结果令人信服地证明来自于顺面小泡中的蛋白是经中间膜囊传递运输的, 并在中间膜囊中被修饰。