点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。
5.荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数
荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过激光共聚焦显微镜可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。
6.胞间通讯研究
动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。激光共聚焦显微镜可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+ , pH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。
7.细胞膜流动性测定
激光共聚焦显微镜设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。
8.笼锁—解笼锁测定
许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用激光共聚焦显微镜可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。
9.粘附细胞分选
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激光共聚焦显微镜是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。
10.细胞激光显微外科及光陷阱技术
借助激光共聚焦显微镜可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过激光共聚焦光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。
11.荧光共振能量转移（FRET）
通过FRET实验可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息,可进行：1）蛋白分子的共定位；2）蛋白分子聚合体；3）转录机制； 4）分子运动； 5）蛋白折叠。
12.生物芯片
生物芯片又被称为DNA微阵列，是以玻片、硅为载体，在单位面积上高密度的排列大量的生物材料，从而达到一次实验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。基因芯片、蛋白芯片等都为生物芯片。所有微阵列上的生物材料发射的荧光须经过扫描装置来分析荧光强度和分布，用激光共聚焦显微镜能获取高质量的图像和数据。
四、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构
激光扫描共聚焦显微镜是由激光器、显微镜、扫描器、探测器以及控制扫描和显示输出的计算机几大部分组成。激光作为光源，通过扫描器内的二向色镜，进入显微镜的物镜。在激发样品后，发射光再次进入扫描器，最后信号被PMT（光电倍增管）检测。信号输出至计算机，显示应该图像。同时计算机也可以通过软件控制扫描器和显微镜，实现图像自动化采集。
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1.激光器
普通光学显微镜使用的一般是混合光，光谱范围宽，成像时样品上的每个光点均会因为色差影响以及由于入射光引起的散射和衍射最终影响成像质量。
激光由于其特殊的激发原理和结构，在激光共聚焦显微镜上有着单色性好、亮度高等很多的优势。
普通光源通常包括了多种颜色，从波长看，就是由多种不同波长的光混合而成。单色光就是指只含有一个波长的光，激光就是如此。激光的单色性好，不仅可以减少色差，而且在仪器设计上也可以简化发射光的单色系统，激发光与发射光易于分离，减少干扰。
激光还是相当好的平行光束，发散角度很小。这样就可以是能量在空间高度集中，同时由于激光发散小，所以聚焦以后能很好的形成小尺寸的光斑，这样就能准确的保证样品中特定点区域的荧光被激发。
激光还有一个显著的特征就是亮度高，强度大。激光的亮度比普通光源高出1000多倍，所以可以保证低功率下激发荧光。
同时，激光有着很好的相干性和偏振性。由于受激辐射的光子在频率和振动方向上相同，相位差恒定，偏振状态也一致。所以在相干性和偏振性上普通光源是无法与激光比拟的。
2.扫描探测器
主要由分光镜、滤光镜、扫描镜、针孔和探测器组成。
分光镜：按照波长的不同来改变光线的传播方向，使激发光能到达样品，而发射光能通过分光镜进入后续检测系统。
滤光镜：能够选择一定波长的发射光进行检测。
扫描镜：通常由X和Y方向的两块镜片组成，通过两块镜片的角度改变，可使激光光斑在样品上逐点移动，完成扫描程序。目前扫描镜有两种方式，第一为常规的检流计式的扫描器，扫描速度较慢，但是扫描分辨率高；第二为新型的共振式扫描器，扫描速度快，但是分辨率较低。
针孔：针孔技术是共聚焦显微镜的主要决定方面。从理论上讲，为了最大程度的消除杂散光，针孔的孔径应该越小越好。但是同时也要保证足够的荧光信号能通过针孔，故在实际应用时应该保证图像亮度的情况下使得针孔尽量小。
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探测器：目前共聚焦显微镜所使用的探测器均为光电倍增管（photo multiplier tube, PMT），其灵敏度极高，响应速度极快。通过调整其电压（或称增益），可以在一定程度提高图像亮度。
3.荧光显微镜
激光共聚焦显微镜中所用的荧光显微镜与常规的荧光显微镜大体相同。同时也有一些特殊的地方，比如，必须配备与共聚焦连接的接口，配备Z轴步进马达以完成三维立体成像，配备光路转换系统方便切换荧光显微镜观察和共聚焦观察方式，并且所用的物镜最佳为复消色差物镜，一般为最高等级的全自动荧光显微镜。
4.计算机系统
计算机控制整个激光共聚焦系统和显微镜电动系统，一切机械操作均可通过安装于计算机上的软件系统远程操控。
五、激光扫描共聚焦显微镜的主要操作步骤
激光扫描共聚焦显微镜的载物台可以放置载玻片、培养皿、多孔板等多种器皿。但如果要在激光扫描共聚焦显微镜下得到最佳的成像效果，载玻片以及培养皿和多孔板底部应该为玻璃的，且要厚薄均匀。
根据具体实验要求选择好制样器皿做好样品后，按照以下步骤进行操作观察：
1.开启全自动荧光显微镜的电源及其光源； 2.开启激光光源；
3.开启激光共聚焦显微镜的控制单元；
4.将样品置于载物台上，并在常规荧光观察模式下找到所要观察的目标； 5.将光路切换至共聚焦观察方式；
6.开启计算机工作站，并打开共聚焦控制软件； 7.选择荧光探针相应的激光谱线； 8.选择实验相应的扫描方式
目前常规共聚焦显微镜的扫描方式包括：① XY或XZ二维图像扫描；② XYZ三维立体图像扫描；③ 时间序列扫描；④ 多波长扫描；⑤ 多点扫描等。具有光谱功能的共聚焦显微镜还可进行全光谱扫描。对于一些具有超高速扫描功能的
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共聚焦显微镜，在选择快速扫描模式时，可记录快速的荧光变化如钙振荡等。对于具有双扫描头的共聚焦显微镜，在选择双扫描模式时，可记录同步光刺激下样品荧光的变化如FRAP、光致转化等。
9.根据样品实际情况，调节共聚焦针孔、激光能量、曝光时间、PMT增益、选择合适的分辨率等，得到一个清晰的共聚焦图像。
六、双光子（多光子）激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题：一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。
在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。
使用单激发光源，双光子具有相同的波长，该技术被称为双光子激发荧光显微术。如果两个光子具有不同的波长，就称作双色激发荧光显微术。
双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度（两个光子必须在10
－18
秒内到达）。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域
的荧光团才会被激发。钛宝石激光器等锁模的，高峰值功率激光可以为双光子激发提供足够的强度。
由于激发强度随到焦平面的距离的平方变化，在z轴方向双光子激发几率随离焦距离的四次方衰减，荧光团激发只发生在焦点内。用数值孔径为1.25的物镜，激发波长为780 nm，全部激发荧光的80%被局限在焦平面1微米范围内，激
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