（四）荧光显微镜的操作注意事项
1.因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含有紫外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。
2.为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15 min后才能关闭。
3.汞灯熄灭后,待其完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸汽尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电极，更重要的是汞蒸气的溢出，会导致工作室的污染。故关闭汞灯之后不能马上再次打开，必须等待至少30 min。
4.高压汞灯工作室会散出大量的热量，因此，工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
5.汞灯使用寿命约200～300 h，在电源控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计小时数，达到300 h需更换新灯泡，否则亮度不够将影响观察。
（五）荧光显微镜标本制作特点和观察要求
1.载玻片 载玻片厚度应在0.8～1.2 mm之间，玻片太厚吸收光多，激发光难以在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
2.盖玻片 盖玻片厚度应约0.17 mm，光洁。为加强激发光也可用干涉盖玻片，这种特制盖玻片的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁），它可以使荧光顺利通过而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本中的荧光。
3.标本 组织切片或其他标本不能太厚，一般以5～20 ?m为宜，切片太厚可使激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察的标本上部不能被激发。切片折叠或杂质过多均可影响荧光的观察。
4.封片剂 封片剂必须无自发荧光、无色透明。加上抗淬灭剂后再用指甲油（实际操作中指甲油封片效果很好，可做到薄而均匀）将盖玻片四周封固，既保持盖玻片不滑动，又能防止抗淬灭剂的蒸发。在没有抗淬灭剂的情况下，也可使用含30％甘油的PBS，还可用甘油与0.5 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0～9.5）
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等量混合液作封片剂。
5.镜头的清洁 在油镜使用完毕后，需用擦镜纸沾上无水乙醇或醇醚混合液（3：7）轻轻擦拭。
6.及时观察 标本染色后应及时观察，因时间过长荧光会逐渐减弱。若标本放在聚乙烯塑料袋中置于4℃保存，可延缓荧光减弱时间。
三、倒置显微镜 （一）用途：
倒置显微镜是为观察研究培养皿内的细胞、组织而设计制造的，其造型特点是标本置于物镜上方，照明光线自上朝下走向，物镜朝上；从人机关系学的观点出发，这样的造型设置有利于显微镜操作者在显微镜上长时间工作。 （二）V型与U型倒置显微镜
（a）
图2-13 倒置显微镜外形
（b）
图2-13（a）为“V”型造型的倒置显微镜，来自物镜成像光线只经过一次反射即到达目镜，光学系统简洁，像质好，是一种普及型产品。
图2-13（b）为“U”型造型的倒置显微镜，来自物镜的成像光线在显微镜基座底部像“U”字母样被折拐两次，光线先往下，后再折拐朝上。这样设置的好处是可以把物镜转换器的空间腾出来，便于添加各类功能附件，使产品具有很好延展性，是一种研究型显微镜。
（三）倒置显微镜的光学与结构特点：
1. 物镜：倒置显微镜的物镜应对培养皿玻壳厚度1.2 mm校正好像差，其物
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镜工作距离应大于玻壳厚度——长工作距，高级物镜还带有盖玻片校正环，适应不同培养皿玻壳厚度的像差校正。
2. 长工作距聚光镜：便于在显微镜载物台上有足够空间来安置培养皿与显微操作器。
3. 光学系统必须有相差功能，因为培养皿内的细胞多是不染色的。 4. 倒置显微镜上可汇集当代所有的显微术与最先进的仪器结构，如：荧光、相差、光导纤维照明、激光共聚焦、全自动控制、全内反射、恒温、热台、显微操作器，是生命科学研究中重要的实验室设备。
四、相差显微镜：
其另一个名称是“相衬显微镜”。相差显微镜是光学显微镜发展史上的一项创新技术。19世纪30年代荷兰物理学家Zernike首先设计，并于1942年制造了第1台相差显微镜。由于此项发明，Zernike于1953年获诺贝尔奖。
（一）基本原理
人的眼睛只能鉴别可见光波长（颜色）和振幅（强度）的变化，不能鉴别相位的变化。但是大多数活的生物样品高度透明，光波通过后振幅基本不变，却存在相位的变化，只是人的眼睛感觉不到。Zernike设计的相差显微镜，能将人眼看不见的样品本身的相位差（或光程差）转变为人眼能看见的振幅（光强度）变化。
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通过相差显微镜示意图2-14中可以看出，相差显微镜与一般显微镜结构上不同之处在于：相差显微镜的聚光镜具有环状光阑，物镜的后焦面处装有相位板。
相差显微镜的基本原理是：光线通过标本后，产生直射光线和衍射光线，直射光线和衍射光线干涉后将在像平面上成像。对于已染色的标本而言，由于标本各点吸收光不同，直射光线和衍射光线在像平面上干涉后，成为一个眼睛可以感知的亮度（振幅）有变化的像；如果光线通过的是活细胞，亮度或振幅的变化没有或很小，但直射光线超前于衍射光线1/4波长，二者干涉后人眼感觉不到。为了人眼能感知，相差显微镜进行了巧妙的光学设计：在物镜后焦面处设有环形的相位板，在聚光镜上设有环状光阑，并且设计环状光阑的像恰好在物镜后焦面上。由于相位板材料的光学特性和厚度可人为控制，可使通过它的直射光线超前或滞后衍射光线1/4波长。如果使用令直射光线超前1/4波长的相位板，直射光就较衍射光共超前1/2波长，直射光和衍射光干涉后，光波振幅减弱，造成像暗背景亮，称为正相差；反之，如果使用令直射光线滞后1/4波长的相差板，直射光将与衍射光同相位，直射光将与衍射光干涉后，光波振幅增强，造成像亮背景暗，称为负相差。因此，相差显微镜实现了从相位差（或光程差）向振幅差（光强度差）的转变。
（二）配置
相差显微镜是由图2-15的配件加至普通光学显微镜上而成.。
2 1 3 4
5
图2-15 相差聚光镜配置图
图2-15中，序号1是相差聚光镜，装置有环形光阑的环形光阑板4可以插
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入该聚光镜的槽口中，序号5是相差物镜，装有相位板，外壳上有“Ph”标记，不同倍率相差物镜有各自对应环形光阑配套，序号3为绿滤光片，用于提高图像衬度。序号2为对中望远镜，用于调校相衬装置。 （三）操作
1. 使用相差物镜与相差聚光镜对被检标本正常对焦观察。
2. 相差聚光镜上的孔径光阑开大，根据物镜倍率将对应的环形光阑插进该聚光镜槽口，推入光路。
3. 此时环形光阑的环孔成像于物镜相位板上，两者应共轴，相位板的环应完全覆盖环形光阑的影像。
用图2-15中序号2对中望远镜取代显微镜上的目镜，可以通过对中望远镜
观察到如图2-16的共轭图。
环形光阑的中心位置通过本配置里提供的专用螺丝来调整，聚光镜的升降可以调整环形光阑在相
位板上的影像尺寸。
图2-16 环形光阑与相位板共轭图 图2-6中（C）图表示环形光阑调整到位。
本步骤在相差观察的调整中，至关重要。
4. 拔下对中望远镜，换上普通目镜，就可通过目镜看到相差显微图像。
5. 相差装置均是针对绿光波长设计制造的，为了得到精确的光线光程差，建
议把绿滤光片加到照明光路中，以达到理论上的最佳光线干涉效果。 6. 由于直射光线完全被相位板阻挡，直射光线强度被压抑，所以相差观察时，
显微镜的照明光源的功率应增强，以提高相差图像亮度。 （四）相差图像特点及相差装置进展：
1. 由于相差图像的对比度提高，使原先在显微镜明视野中不易发现的细胞、组织得以观察，相差显微镜可用于观察活细胞、未染色的组织切片或缺少反差的染色标本。
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