得益于近年来产溶剂梭菌遗传操作技术的快速发展，研究者们已经能够在分子水平对该类微生物进行改造以克服其发酵性能上的缺陷，进而提高菌株的发酵能力和经济性， 但目前距离工业生产需求仍有一定差距。造成上述结果的主要原因是我们对于产溶剂梭菌这类严格厌氧微生物复杂的生理生化机制的认知仍然有限，无法对菌株进行高效的设计和改造。基于此，采用“反向代谢工程”技术是加快目前产溶剂梭菌研究进度的有效策略之一[2]。在反向代谢工程研究中，转座子随机突变是一种重要的技术手段。
我们以两种重要的产溶剂梭菌模式菌株—丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌作为研究对象，建立了高效的基于mariner转座子的诱导型随机突变方法，获得了高质量的单基因突变体库，转座效率90%以上，且转座突变具有很好的随机性。在此基础上，上述突变体库被用于优势表型筛选，分别获得了一株产量显著提高的丙酮丁醇梭菌和对玉米秸秆水解液抑制物耐受能力显著增强的拜氏梭菌。上述结果证明了基于mariner转座子的产溶剂梭菌随机突变技术平台在优势表型筛选中的作用。
参考文献
[1] Tracy B. P., Jones S. W., Fast A. G., et al, Curr. Opin. Biotechnol., 2012, 23 (3) , 364-381.
[2] Zhang Y., Grosse-Honebrink A., Minton N.P. PLoS One, 2015, 10, e0122411
ATG22敲除对醋酸胁迫下酿酒酵母程序性细胞死亡作用
董亚晨 胡竞进 陈启和
浙江大学食品科学与营养系； 浙江省食品微生物技术研究重点实验室， 杭州 310058
摘要：醋酸阻断了酿酒酵母细胞的胞内氨基酸营养吸收，启动了程序性细胞死亡。Atg22是一种液泡内膜蛋白，它对于液泡内氨基酸进出与自噬性降解是必须的。本文重点开展ATG22基因在酵母细胞应对醋酸胁迫死亡过程中的作用机制。我们检测了几种凋亡标记因子，研究发现Atg22的敲除和过表达分别延迟和提高醋酸胁迫下酵母细胞的程序性死亡。基于表观上分析，酵母Atg22蛋白的表达受到醋酸作用的抑制。而且，Atg22基因敲除的酵母细胞在醋酸处理后胞内氨基酸和NH3大量的积累，这可以帮助应对细胞氨基酸饥饿和胞内环境酸化。与此同时，在ATG22基因敲除后的细胞中系列胁迫保护基因也在转录水平上发生上调。本研究结果为解析Atg22p在醋酸导致的程序性细胞死亡中的作用提供了依据，也为改善工业酿酒酵母其醋酸耐受能力提供了新靶标。
参考文献
[1] Almeida, B., Ohlmeier, S., Almeida, A. J., Madeo, F., Leao, C., Rodrigues, F. and Ludovico, P. (2009). Yeast protein expression profile during acetic acid-induced apoptosis indicates causal involvement of the TOR pathway. Proteomics 9, 720-732.
[2] Bauer, B. E., Rossington, D., Mollapour, M., Mamnun, Y., Kuchler, K. and Piper, P. W. (2003). Weak organic acid stress inhibits aromatic amino acid uptake by yeast, causing a strong influence of amino acid auxotrophies on the phenotypes of membrane transporter mutants. European Journal of Biochemistry 270, 3189-3195.
[3] Carmona-Gutiérrez, D., Bauer, M. A., Ring, J., Knauer, H., Eisenberg, T., Büttner, S., Ruckenstuhl, C., Reisenbichler, A., Magnes, C., Rechberger, G. N., Birner-Gruenberger, R., Jungwirth, H., Fröhlich, K. U., Sinner, F., Kroemer, G. and Madeo, F. (2011). The propeptide of yeast cathepsin D inhibits programmed necrosis. Cell Death and Disease 2, e161.
苏云金芽孢杆菌L-异亮氨酸羟化酶的酶学性质及其在酶法合成4-
羟基异亮氨酸中的应用研究
张成林 麻杰 薛宁 王鑫鑫 刘远 陈宁*
天津科技大学生物工程学院代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室；工业微生物教育部重点实
验室，天津 300457
摘要：4-羟基异亮氨酸( 4-Hydroxyisoleucine, 4-HIL)具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性以及增强肌细胞对血糖吸收、加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用，因此具有广泛的应用前景和市场需求。目前采用胡芦巴种子提取法生产的4-HIL构型多样且提取率，而仅(2S, 3R, 4S)-4-羟基异亮氨酸具有生物学活性。本文克隆了来源于苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis TCCC 11826的L-异亮氨酸羟化酶 (L-isoleucine-4-hydroxylase, IDO)编码基因ido，测序发现该基因含723个核苷酸，编码240个氨基酸，未见相同序列基因的报道。氨基酸序列分析发现该IDO含有His1-X-Asp/Glu-Xn-His2 基序，属于Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶家族。成功构建了ido基因过表达菌株BL-IDO并采用Ni-NTA 亲和层析法分离纯化重组IDO后检测其酶学特性，结果表明该酶能够特异性地催化L-异亮氨酸生成 (2S, 3R, 4S)-4-HIL，其Km和Vm分别为0.18mmol/L和2.10 μmol/min/mg，最适反应温度和pH分别为35℃和7.0，于35℃条件下反应5h后仍具有85.1%的活性。BL-IDO经培养、IPTG诱导并冷冻处理后于适宜条件下能够特异性地催化异亮氨酸生成 (2S, 3R, 4S)-4-HIL，其转化率最高可达90.7 %。本文新发现了一段IDO编码基因序列(Accession No. KC884243)并首次较为系统地研究了其酶学特性，该酶反应条件温和且具有较高的活性及稳定性，在酶法合成4-HIL中具有一定的应用价值。本研究可为4-HIL及其它氨基酸衍生物的生物制造技术奠定理论基础。
Acetobacter sp.生物合成3-HP转化机制及催化技术研究
李俊 陆信曜 宗红 诸葛斌
江南大学生物工程学院，无锡214122
摘要：3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)是一种具有高经济价值的重要工业用化学中间体，具有广泛的应用前景[1-6]，但目前尚未实现工业化生产。本实验室前期研究已筛选获得了一株可高效催化1,3-丙二醇（1,3-PDO）合成3-HP的菌株—Acetobacter sp. [7]，本课题旨在探明1,3-PDO经全细胞催化合成3-HP的醇脱氢氧化过程和机理，并通过驯化培养获得具有高底物耐受性的菌株，利用细胞固定化催化合成3-HP，以期为生物合成3-HP提供一种新方法。
经过多轮次底物胁迫驯化获得了能够耐受高浓度1,3-PDO（50 g/L）的子代菌株，同时菌体的催化活性也得到了相应提高。以提高菌体的呼吸链水平为切入点，通过优化碳源组合和添加辅酶Q前体物质、生长因子以及辅酶金属离子，对培养基进行优化，使Acetobacter sp.生物量增加了55.9%。 通过固定化技术在3-HP生物合成中的应用，利用Acetobacter sp.催化反应80 h后，3-HP的产量最高达34.96 g/L，摩尔转化率为86.79%。且固定化细胞在重复利用5次之后转化率仍高于80%，在4 °C的条件下贮存100 h后其催化能力仍能保持在较高水平。功能菌体Acetobacter sp.的固定化研究工作克服了工业实际应用的中存在的操作难点，固定化细胞具有良好的生产应用稳定性，为生物转化合成3-HP的工业生产提供借鉴。这一研究结果为生物合成3-HP提供了新思路，具有重要的参考价值。