创伤外科杂志&"")年第*卷第!期,UPQ;V6;1VQA，&"")，WK<-*，XK-!
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文章编号：!""#$%&’(（&"")）"!$""*+$"!
经验交流
人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞
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李海红!，，付小兵!，张庆红&，周,岗!，孙同柱!
（!-解放军总医院’"%临床部全军创伤修复重点实验室，北京,!"""’(；&-郧阳医学院附属太和医院，湖北十堰,%%&"""）,探讨人骨髓间充质干细胞（/0123）体外分离培,,摘要：
养、鉴定以及分化。认为/0123在体外很容易分离培养和扩增，成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为脂肪细胞。
表达阴性；流式细胞仪示2B%%阳性率为*#-)%>，2B’%为"-!!>。细胞周期检测显示第’代/0123中."@.!期的细1O.&O0期占#-%)>，第!"代中."@.!期胞占#"-+%>，
关键词：人骨髓间充质干细胞；分离培养；脂肪细胞中图分类号：4’&#-&,,文献标识码：5
骨髓中存在着一类被称为间充质干细胞（673789/:6;<3=7697<<3，0123）的非造血干细胞，这些细胞具有强大的多向分化潜能，特别是跨胚层分化能力，且0123来源丰富、分离培养简单、具有高度增殖能力。笔者就人间充质干细胞的分离、培养和诱导分化作一探讨。
材料与方法
4,实验方法,无菌条件下穿刺正常人髂后上嵴，抽取骨髓约&6<，
采用直接贴壁法，以含!">胎牛血清、青霉素（!""?@6<）和链霉素（!""!A@6<）的B0C0@D!&为培养液（即/0E123培养液），在’(F、体积分数+>2G&，饱和湿度的孵育箱内培养，&%小时后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每&H’天换液!次。待细胞达*">融合时，用"-&+>的胰蛋白酶’(F消化，加入上述/0123培养液，按!I’比例传代培养。分别用免疫细胞化学法和流式细胞仪法对/0123的表面标记进行检测，同时检测第’代和第!"代/0123的细胞周期。第!"代/0123达*">H#">融合后，行定向脂肪诱导，试验组加入JEB0C0诱导液（含!">胎牛血清，!""?@6<青霉素，!""!A@6<链霉素，!!6K<@L地塞米松，!"!A@6<胰岛素，"-+66K<@LM50N，对照组加入JEB0C0培养液（含!">胎牛血清，!""?@6<青霉素，!""!A@6<链霉素），每&H’天换液!次。分别在培养第!和第&周行油红“G”染色，苏木素复染。
5,结果,采用直接贴壁法培养/0123，&%小时后可观察到培养的上清中有很多的漂浮细胞及少量贴壁细胞，根据形态的不同，贴壁细胞可分为’种：小圆细胞、星形细胞和梭形细胞（即/0123）。贴壁细胞前&H’天生长缓慢，之后迅速增殖，且以梭形细胞占优势，(天左右达融合。通过间断摇动培养瓶，可使骨髓血中大量的红细胞、白细胞等漂浮细胞与贴壁细胞分离。由于梭形细胞的优势生长，第’代时，几乎全为梭形细胞，随着传代次数的增加，/0123变得宽大扁平，。第’代培养的细胞免疫细胞化学示/01232B%%和2B!"+表达阳性，但2B!"+的强度弱于2B%%的强度，2B’%基金项目：国家重点基础研究发展规划资助项目（.!###"+%&"%）,,,,,国家自然科学基金（’"!("#))，’"&’"’("）,,,,,国家杰出青年基金（’#+&+"&%）
收稿日期：万方数据&""+$"!$!"；修回日期：&""+$"#$"%
的细胞占(*-)&>，1O.&O0期占&!-’*>为，提示绝大部分细胞处于静止态，少部分处于功能态。第!"代/0123加入脂肪诱导剂后，诱导第!周油红“G”染色见胞质中有许多红染的细小颗粒，第&周胞质中红染颗粒聚集增大，脂滴聚集达高峰。诱导时间延长达%周以上，脂肪细胞因从基质脱离而死亡。
讨,论
0123存在于骨髓基质中，对骨髓中的造血干细胞起支持作用，骨髓中的0123含量极少，约占骨髓中有核细胞的"-""!>H"-"!>，但由于012很容易分离纯化和扩增，并且具有多能性而使其成为理想的干细胞来源。
目前，尚未发现0123的特异性标志，而是借用间充质细胞、内皮细胞、上皮细胞和肌细胞的特点，0123的表面标志主要有黏附分子、生长因子和细胞因子、生长因子受体和细胞因子受体、整合素等，尤其是强表达2B%%———多种配体的受体，但不表达典型的造血干细胞抗原2B%+、2B’%和
2B!%［’］
。本研究培养的/0123免疫细胞化学示2B%%和
2B!"+表达阳性，但2B!"+的强度弱于2B%%的强度，2B’%表达阴性，流式细胞仪示2B%%阳性率为*#-)%>，2B’%为"-!!>，符合0123的基本特征标志。细胞周期检测显示第’代/0123中."@.!期的细胞占#"-+%>，1O.&O0期占#-%)>，第!"代中."@.!期的细胞占(*-)&>，1O.&O0期占&!-’*>为，提示绝大部分细胞处于静止态，保留自我更新、增殖和分化能力，少部分处于功能态。
为了诱导/0123向脂肪细胞分化，我们选择了含!E甲基E’E异丁基E黄嘌呤（M50N）、地塞米松、胰岛素、和牛血清的培养基，用油红染色证实获得大量的脂滴，在诱导!周时就可检测到脂滴，&周时脂滴聚集达高峰，诱导时间延长达%周以上，因脂肪细胞从培养瓶脱落而死亡。/0123向脂肪细胞分化的具体机制尚不清楚，PQKR7<等用4PES24方法分析发现基础培养条件下的0123表达脂肪细胞特异性的转录活性基因：脂蛋白脂酶、;S&以及参与控制脂肪分化的转录因子2@C5S"和SST4#!，诱导’周时，细胞表达成熟脂肪细胞的其它标志：SST4#&（SST4#的另一剪接同工型）和脂素。未分化的细胞表达许多种系特异性的转录活性基因，可能是从广泛干细胞室来源的细胞，在不同的分化能力间波动，当给予一定的条件刺激时，就向特定的终末细胞分化，这是细胞具有可塑性的基础，也是012的主要特性。