背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的细胞及基因治疗的靶细胞.目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记骨髓间充质干细胞的方法.设计、时间和地点:开放性实验,于2008-03/05在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史,由南昌大学第一附属医院提供.方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用BrdU标记.主要观察指标:相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞的形态变化;流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞的表面标记以及细胞周期:绘制人骨髓间充质干细胞生长曲线;透射电镜观察人骨髓间充质干细胞的超微结构.结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞.流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞CD90,CD29,CD44,CD34,CD45阳性细胞表达分别为98.48%,98.74%,97.41%.0.36%,0.64%.人骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形.透射电镜可见人骨髓间充质干细胞胞质丰富,粗面内质网发达,大量蛋白分泌物.免疫组织化学检测BrdU标记48 h后人骨髓间充质干细胞标记率80%.结论:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养相结合,以获得纯度较高和活性骨髓间充质干细胞,是简便可行的方法:BrdU是一种简单、有效的标记骨髓间充质干细胞的方法.
7.期刊论文 郭希民.王常勇.王永红.段翠密.赵强.孙大铭 人骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞定向分化的实验研究 -中华口腔医学杂志2003,38(1)
目的探讨人骨髓间充质干细胞体外分离培养和向软骨细胞定向分化的条件,为髁突软骨组织工程提供种子细胞.方法采用 Percoll 分离液,根据细胞密度梯度原理,从健康人骨髓组织中分离骨髓间充质干细胞,对所获得的细胞进行体外培养和表面标志的流式细胞仪分析.对经过鉴定证实的骨髓间充质干细胞用含胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸、地塞米松和 TGF-β的诱导培养基处理7～14 d.对诱导细胞进行蕃红花 O-亮绿染色和Ⅱ型胶原染色,鉴定诱导后细胞的软骨细胞表型.结果培养的人骨髓间充质干细胞均一表达 CD29、CD44,而 CD34、CD45 和 HLA-DR 呈阴性.细胞经过诱导液作用 14 d 后,蕃红花O-亮绿染色和Ⅱ型胶原染色阳性.结论采用比重为1073 g/L 的 Percoll能分离获得高纯度的人骨髓间充质干细胞 (纯度大于95%).该细胞经诱导液作用,可定向分化为软骨细胞.
8.学位论文 杨博 人骨髓间充质干细胞体外的分离培养及在血管紧张素Ⅱ诱导下向心肌样细胞分化的研究 2008
目的：
心肌细胞丢失、瘢痕形成及心室重构是造成心脏功能恶化的主要因素，也是最终导致慢性充血性心力衰竭的主要病理基础。细胞移植治疗是治疗心脏疾病的一种新策略。骨髓间充质干细胞(BMSCs)目前被认为是细胞移植治疗最理想的种子细胞。研究BMSCs体外定向分化为心肌样细胞对细胞移植治疗心脏疾病具有重要的理论和临床意义。
本课题旨在通过血管紧张素II化学诱导等方法体外诱导BMSCs定向分化，检测BMSCs是否可分化为心肌样细胞，观察血管紧张素II对BMSCs生长增殖的影响，对BMSCs分化的可能机制作一探讨。本研究以人骨髓间充质干细胞为研究对象，实验分为两部分，第一、体外分离、纯化、传代人骨髓间充质干细胞(HBMMSc)。第二、血管紧张素II体外对HBMMSc向心肌样细胞的诱导分化的研究。 方法：
1.HBMMSc的分离，培养和传代及鉴定标本来源于正常人的骨髓。采用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，再利用贴壁筛选法纯化骨髓间充质干细胞后，进行原代和传代培养，并对其进行细胞生长和形态学的观察、表面抗原的鉴定。
2.HBMMScs在血管紧张素II的诱导下向心肌细胞的培养分化及心肌细胞的鉴定。收集第8代hBMMSCs，分4组为实验组3组和空白对照组。用0.1 μmol/L Ang II诱导孵育hBMMSCs 24h。通过倒置显微镜形态学观察、半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定诱导细胞是否具备心肌样细胞的形态、结构特点及是否表达心肌特异性蛋白cTnI，GATA-4，Nkx2.5。 结果：
1.hBMMScs原代培养接种24h贴壁完成，2-3天细胞呈梭形，第9天形成多个克隆，第14-16天细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显方向性，细胞排列成漩涡状。传代细胞24h内完全贴壁，伸展成梭形，开始迅速增殖，7天即铺满培养瓶底，传代细胞保持原代细胞的形态特征。随代数增加，细胞得到纯化，梭形细胞达95％以上。连续传代至P8，细胞由梭形变为平坦、宽大，分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡。传至P10，部分细胞变成圆形，折光增强，脱壁死亡。随着传代次数的增加，克隆形成率逐渐下降，10代后无明显克隆出现。流式细胞测定分离提纯后的hBMMScs表达CD29和CD44，不表达CD34和CD45。
2.Ang II诱导的细胞第8-10d即呈棒状，第18-21d细胞为长杆状，走向便趋一致。电泳检测证实.AngII诱导的细胞第2、3、4、5周已经表达cTnI，NkKX2.5，GATA-4，并且随时间推移，蛋白表达增强。空白对照组hBMMSCs无形态变化，不表达心肌特异蛋白。 结论：
1.利用淋巴细胞液进行密度梯度离心法和贴壁筛选法，可分离纯化hBMMSCs，细胞的均一性高，是一种简单，经济有效的分离提纯hBMMSCs方法。并且扩增细胞数量足够，遗传背景稳定，可满足组织工成要求。体外分离、培养hBMMSCs具有很好的成功率及成活率。 2 Ang II在体外可诱导第8代hBMMSCs分化为心肌样细胞。
9.期刊论文 王培蕊.马学玲.王心蕊.文佳媚.陈柏竹.刘亢丁.Wang PR.Ma XL.Wang XR.Wen JM.Chen BZ.Liu KD 人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用 -中国组织工程研究与临床康复2007,11(46)
目的:目前有关骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化的研究较少.本实验分离和培养人骨髓间充质干细胞,用带有VEGF165的质粒转染人骨髓间充质干细胞,探讨血管内皮生长因子对其体外诱导分化的作用.方法:实验于2005～04/2006-04在吉林大学人兽共患病教育部重点实验室完成.取成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓(自愿提供),采用Percoll梯度分离培养骨髓间充质干细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况.原代细胞培养至增殖接近融合状态时,单克隆培养法分离传代培养,扩增骨髓间充质干细胞.采用流式细胞术检测细胞免疫学表型.在原核细胞大肠杆菌DH5α中复制扩增和提取,纯化、克隆pcDNA3.0-VEGF165质粒.用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞.应用流式细胞术检测诱导后骨髓间充质干细胞免疫学表型变化.并采用免疫荧光染色鉴定转染情况,并设质粒空载和未转染的骨髓间充质干细胞为对照.结果:人骨髓间充质干细胞原代培养1周后,造血细胞消失,贴壁细胞体积增大,呈现梭形外观,有粗大的细胞突起伸出.2周后细胞融合成单层,梭形突起变长,排列有明显的方向性,细胞排列成旋涡状、网状、辐射状.流式细胞术显示,人骨髓间充质干细胞免疫学表型CD44、CD29阳性,CD34、CD31、CD45阴性.VEGF165诱导骨髓间充质干细胞后CD44表达明显降低,CD31明显升高.免疫荧光染色显示,用FITC标记后的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光,用cy3标记的CD31抗体使细胞显现了红色荧光.结论:转染后的骨髓间充质干细胞细胞表型发生明显转变,CD31表达率明显增高,呈现典型的内皮细胞的表型特征,这说明骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞分化的潜能.