第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究 第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
2.1 引言
醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2 实验材料与方法
2.2.1 材料与仪器
分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。 试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a 主要仪器设备
Tab 2.2.1.a Main instrument equipment
主要仪器 生化培养箱 双目生物显微镜
分析天平
手提式不锈钢蒸汽灭菌锅
超净工作台 精密数字式酸度计
型号 PYX-250S-A BME（BA/E3）
BS224S DSX-280B SW-CJ-1FD pHS-3C
厂家 长沙科技 科力仪器 德国莱卡 北京化丰 上海南鹏 上海科技
第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
试验试剂： 葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、
K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2 培养基[33-37]
表2.2.1.ｂ 培养基成分表 Tab 2.2.1.ｂMedium composition
名称
葡萄糖 1% 1% 1% 1% 1% 1%
酵母膏 1% 1% 1% 1% 1% 1%
无水乙醇(v/v) 3% 3% 3%
琼脂
CaCO3
备注 pH 4. 5 pH自然 pH自然 pH自然 pH自然 pH 4. 5 pH自然 pH自然 pH自然 甘油3% pH自然 乙酸钙1% pH
7.2 乳酸钙2% pH7.0-7.2 pH自然
⑴ ⑵ ⑶ ⑷ ⑸ ⑹ ⑺ ⑻ ⑼ ⑽ ⑾ ⑿ ⒀ ⒁
基础发酵培养基
分离培养 斜面保藏培养基 液体保藏培养基 改进后的斜面液体
保藏培养基 发酵培养基 Horyer-Frateur培养
基 GYC培养基 高糖培养基 生酮培养基 产5-酮基葡萄糖酸
盐培养基 氧化乙酸培养基 氧化乳酸培养基 乙醇培养基
2% 2%
2% 1% 1% 1%
3% 7% 3%
2%
2% 2% 2% 2% 2% 2% 2%
2. 5% 2%
10% 30%
5% 1% 3% 1% 1% 1%
2% 3%
3% 1% 1% 1%
注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体
培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%， KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
2.2.3 醋酸菌的分离纯化 2.2.3.1 分离纯化实验
称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，
第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。
连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4℃的冰箱。
2.2.3.2 革兰氏染色实验
将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h，制作水晶镜片进行革兰氏染色。
2.2.3.3 产醋酸定性实验[38]
取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3% (v/v) 的无水乙醇， 32℃震荡培养60 h，取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液（2.5 mol/L）调节pH至7.0，加入5~6滴5% FeCl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。
根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39]为醋酸菌。
2.2.3.4 醋酸定量实验
经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32℃、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。
醋酸定量测定[40]：
精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中，并加入蒸馏水50 mL，滴加1~2 滴0. 5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微粉色。
产酸量(g/L)=(V-V0)×CNaOH×60/样品毫升数； 式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；
V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数； CNaOH=NaOH溶液的浓度(mol/L)； 60为醋酸分子量。
2.2.3.5 耐酒精能力实验
初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32℃恒温培养3d，观察其是否生长，筛选出耐酒精性能好的菌株。
第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
2.2.3.6 传代稳定性实验[41]
将上述所筛选出的菌株，每隔一个月，转接纯化后的菌株，连续转接培养7代，并测定其酸度，来判断、筛选，传代最稳定和产醋酸最高的菌株。
2.2.3.7 不同保藏方法保藏醋酸菌的存活期限实验[43]
将传代相对稳定性的菌株，分别按照培养基2.2.2中的⑶、⑷、⑸转接，待斜面上菌苔丰厚，保藏于2℃～4℃的冰箱内，每隔三个月再次转接，并观察其存活情况。
2.2.4 菌种鉴定实验[44-45] 2.2.4.1 培养实验观察
通过平板培养，观察菌落形态特征，并挑取单个菌落制做水晶片，革兰氏染色，同时在1000倍光学显微镜下观察其细胞形态、大小和排列特征。
2.2.4.2 培养特征实验
⑴观察所选菌株在平板上培养的情况； ⑵观察所选菌株是否能在高糖培养基上生长；
⑶观察所选菌株是否能在Hoyer-Frateur培养基上生长。
2.2.4.3 生理生化实验[46]
⑴接触酶的试验：
在长势旺盛的平板上，滴加3%的H2O2，观察有无气泡产生。 ⑵以铵盐为唯一氮源的生长试验： 观察在培养基2.2.2中⑺中生长情况。 ⑶GYC培养基产色素试验：
观察在培养基2.2.2中⑻上能否生成棕色的水溶性色素。 ⑷生酮试验(甘油生成二羟丙酮的试验)：
在培养基2.2.2中⑽上，将费林液注满平板，观察菌落周围是否有红色沉淀出现。
⑸产5-酮基葡萄糖酸盐试验：
在培养基2.2.2中⑾上，32℃培养24 h后，观察菌落周围是否有白色不透圈。 ⑹葡萄糖产酸试验：
第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
观察培养基指示剂是否变色。 ⑺产纤维素试验：
在含糖培养基上向菌落上滴加Lugol碘液和60%硫酸液，观察菌落周围变化情况。
⑻氧化乙酸的能力试验：
在培养基2.2.2中⑿上，32℃培养48 h，观察菌落周围是否出现乳白色的晕圈。
⑼氧化乳酸的力试验：
在培养基2.2.2中⒀上，32℃培养48 h，观察菌落周是否出现乳白色的晕圈。 ⑽在以乙醇为唯一碳源的培养基上，观察其能否生长。
2.2.5 发酵条件实验
⑴发酵温度单因素实验
以培养温度为梯度，26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，将筛选所得的菌种，分别接种于装有100mL醋酸菌发酵培养基的500mL三角瓶中，置于180r/min的恒温摇床培养72h，以产酸量和醋酸菌数来确定最佳生长条件。
⑵将筛选所得的菌种，分别接种于分离平板上，观察出现透明圈的时间，确定最快产酸时间。
2.3 结果与分析
2.3.1 分离筛选
⑴分离纯化：从分离平板中挑选出107个单菌落菌株。
⑵初步筛选：通过醋酸菌分离培养基筛选，选出44个单菌落产酸菌株。 ⑶复筛：又经革兰氏染色和醋酸定性试验，淘汰了革兰阳性及不产醋酸的菌株，选出4株醋酸菌株。
⑷产酸定量试验，筛选出产酸量大最快的菌株，结果见下图2.3.2.A