第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
454035产酸量g/L302520151050020406080时间h100120140160X1X2X3X4
图2.3.1.A 4株醋酸菌产酸量测定
Fig 2.3.1.A Four strains in determination of acid acetic acid bacteria
⑸耐酒精能力试验，筛选出耐酒精性能好菌株，结果见下图2.3.2.B
141210耐酒精度(%)86420X1X2X3X4
图2.3.1.B 4株醋酸菌耐酒精测定
Fig 2.3.1.B 4 of acetic acid bacteria resistant to alcohol determination
⑹然后继续对2株性能较好菌株进行传代培养，确定其传代的稳定性。每一代产酸量见下表2.3.1.a。
表2.3.1.a 4珠醋酸菌传代培养每代产醋酸的测定(g/L) Tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin)
cultivating the determination of acetate(g/L)
第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
菌株号 1代 2代 3代 4代 5代 6代 7代
X1 38.2 39.4 38.3 37.4 35.1 30.6 28.4
X2 30.9 31.5 30.4 27.3 27.9 24.1 21.8
X3 31.3 31.5 30.1 26.3 22.7 19.5 14.7
X4 41.8 43.4 42.3 40.6 38.7 36.9 35.5
由表2.3.1.a可以看出，每代发酵培养中，菌株X4的醋酸产量最高，并在传代培养过程中产量稳定，故选该菌株为目的菌株。
⑺存活期限试验：
把X4菌株接入三种斜面保藏培养基，每隔三个月接种到各方法所用的培养基上。观察其存活情况，见表2.3.1.b：
表2.3.1.b 三种方法保藏醋酸菌的存活时间
Tab 2.3.1.b Three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial
时间/月 斜面法 液体法 改进斜面
3 ﹢ ﹢﹢ ﹢﹢﹢
6 ﹣ ﹢﹢ ﹢﹢
9 ﹢﹢ ﹢﹢
12 ﹢﹢ ﹢﹢
15 ﹢﹢ ﹢﹢
18 ﹢ ﹢﹢
21 ﹣ ﹢
24 ﹢
注： “+”表示生长； “++”表示生长良好；”﹣”表示不生长。
从2.3.1.b看可以出，普通斜面保减法保藏的保藏时间小于3个月；而液体保藏法的保藏时间大于18个月；但改进后的斜面液体保藏法，能在20个月内都保持生长良好，且保藏的时间可达24个月。
醋酸菌所产的酸，是造成醋酸菌保藏时间受到限制的原因之一。随着保藏时间的延长，尽管醋酸菌能抵抗一定的酸，但一直处在酸性环境中，醋酸菌会被自己产的酸所杀灭。
因此，在菌种生长的很健壮后又加入碳酸钙和液体培养基，既降低了氧气的含量，又中和了产生的醋酸，使其在生长和保护方面较液体保藏更加先进了一步，保藏效果也更好。
2.3.2 分析鉴定结果 2.3.2.1 菌株X4形态特征
显微镜下细胞呈椭圆或短杆状，无芽孢，单个或成对、成链排列。
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2.3.2.2 X4培养特征
X4在基础平板培养基上生长旺盛，形成灰白色圆形菌落，表面光滑、凸起，边缘整齐，培养48h能产酸，使CaCO3溶解形成明显的透明圈。
继续培养能氧化乙酸产生CO2和H2O，菌落周围出现乳白色透明圈。在斜面培养基上生长良好，培养2 d产酸。能在12% (v/v)乙醇的培养基上和30%葡萄糖培养基上生长，但在Hoyer-Frateur培养液中不生长，也不产色素。
液体培养摇瓶产酸较快，静止培养时在液面形成少量菌膜，产酸较慢。平板菌落形态见下图2.3.2.A：
图2.3.2.A X4菌落形态图
Fig 2.3.2.A X4 colony morphology diagram
2.3.2.3 生理生化实验结果
⑴接触酶试验阳性，试验说明X4为好氧菌，所以迅速形成大量气泡。 ⑵在Hoyer-Frateur培养液中不生长。 ⑶在GYC培养基不产生水溶性棕色色素。 ⑷生酮试验结果为阴性，无红色沉淀出现。 ⑸不产生5-酮基葡萄糖酸盐。 ⑹产葡萄糖产酸试验结果为阳性。 ⑺产纤维素试验结果为阴性。
⑻氧化乙酸试验为阳性，试验说明X4可以氧化乙酸钙，产生CO2和水，CO2又和钙结合成乳白色的晕圈。
⑼氧化乳酸试验为阳性，试验说明X4可以氧化乳酸，产生CO2和水， CO2
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又和钙结合成乳白色的晕圈。
⑽以乙醇为唯一碳源的培养基生长试验试验说明X4可以在以乙醇为唯一碳源的培养基生长。
2.3.3 分析鉴定结果
在以上生理生化试验的基础上，查阅《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定分析。
⑴根据表2.3.3.a可以看出，X4氧化醋酸和乳酸成CO2和H2O，所以X4为醋酸杆菌属，而不是葡糖杆菌属和假单胞菌属。
表2.3.3.a 葡糖杆菌、醋酸菌属、假单胞菌属比较表
Tab 2.3.3.a Glucnobacter、Acetobacter、Pseudomonas Comparison table 生理生化特征 鞭毛运动作用 于PH4.5可生长
氧化：PH4.5时氧化乙醇成醋酸
醋酸氧化成CO2 乳酸氧化成CO2 葡萄糖氧化成葡萄糖酸 静止细胞氧化氨基酸 Krebs循环（三羧酸循环） 产生5-酮基葡萄糖酸产生
生酮作用 醌类： Q10
Q9
水解： 乳糖和淀粉
明胶
呈绿色或荧光色素
葡糖杆菌属 极生或没有
+ +(M) - - + - - + + + - - -/W -
a
醋酸菌属 周身或没有
+ +(S) + + d + + d d - + - - -
假单胞菌属
极生 - - d + d + + - - d d d
注：此表引用《伯杰氏手册》第326页；a、M.中等；S.强；W.弱。
⑵根据表2.3.3.b比较出，根据接触酶试验、甘油生酮试验、产纤维素试验和以乙醇为唯一碳源生长试验结果区别于其他菌株，所以判断X4为巴氏醋杆菌罗旺亚种 (A· lovaniensis)，并进行相同试验，得出结论X1为巴氏醋杆菌埃斯群亚种(A·estunensis)。
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表2.3.3.b 各类醋酸菌特征表
Tab 2.3.3.b All kinds of acetic acid bacteria features list
醋化醋杆菌
A1
A2 醋化醋杆菌奥
A3 醋化醋杆菌木
A4 醋化醋杆菌液
B1 巴氏醋杆菌巴
B2 巴氏醋杆菌罗
巴氏醋杆菌
B3 巴氏醋杆菌埃
B4 巴氏醋杆菌攀
B5 巴氏醋杆菌奇异亚种 （-） -
过氧化醋杆菌 C
醋化醋杆菌亚
接触酶 在甘油或赤鲜醇中生酮 形成5-酮葡萄糖酸
盐 形成2-酮葡萄糖酸盐 葡萄糖酸盐 在乙醇上生长 产生：纤维
素 γ-吡喃酮 褐色素 G+C，克分子/%
尔兰质亚化亚氏亚旺亚斯群升亚亚种 种 种 种 种 亚种 种
（+） （+） （+） （+） （+） （+） （+） （+） 种 +a
+a
+a
+a
-b
-b
-b
-b
过氧化醋杆菌
（-） -
（+） （+） （+） （+） - - - - - -
（+） （+） （+） （+） d - - - -
+ + - - - 59-65
+ - - - - 60-61
+ （-） + - - 62-63
+ + - + + 64
（+） （-） - - - 55-62
+ + - - -
+ + + - - 62
- - - - -
- - - - - 55-56
- + - - - 61-64
注：此表引用《伯杰氏手册》第365页；a.中度到强；b.阴性或很弱；( ).通常为
阳性或阴性。
2.3.4 发酵条件实验结果
⑴培养72h后，分别检测各个温度下产酸量和总菌数，结果见下图2.3.4.A和表2.3.4.b：