实验一 脂肪的定量测定
——索氏（Soxhlet）提取法
一、目的和要求
1. 学习和掌握粗脂肪提取的原理和测定方法。
2. 熟悉和掌握重量分析的基本操作，包括样品的处理、定量转移、烘干、恒重等。
二、原 理
本法为重量法，用脂肪溶剂将脂肪提出后进行称量。该法适用于固体和液体样品，通常将样品浸于脂肪溶剂，如乙醚或沸点为30-60度的石油醚，借助于索氏提取管进行循环抽提。本法提取的脂溶性物质为脂肪类似物的混合物，其中含有脂肪，游离脂肪酸，磷脂，酯，固醇，芳香油，某些色素及有机酸等，因此，称为粗脂肪。
用该法测定样品含油量时，通常采用沸点低于60度的有机溶剂，此时，样品中结合状
态的脂类（脂蛋白）不能直接提取出来，所以该法又称为游离脂类定量测定法。
脂肪类化合物一般都溶于有机溶剂（如乙醚、石油醚）而不溶于水或微溶于水，利用此特性，可以用索氏脂肪提取器抽提出样品中的脂肪。 索氏脂肪提取器——索氏（Ｓｏｘｈｌｅｔ）脂肪提取器为一回馏装置,由浸提管、小烧瓶及冷凝管三者联接而成，浸提管两侧分别有虹吸管及通气管。盛有样品的滤纸包放在浸提管内，溶剂乙醚（或石油醚）盛于小烧瓶中，加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝的溶剂滴入浸提管，浸提样品。浸提管内溶剂愈积愈多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中脂肪类物质经虹吸管流入小烧瓶。 小烧瓶的溶剂由于受热而汽化，气体至冷凝管而滴入浸提管内，如此反复提取回馏，将样品中脂肪类物质提尽并带到小烧瓶中。最后将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，小烧
瓶的增重 ，就是样品中所含脂肪的量。
因本法提取的物质，除中性脂肪外，还会有游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质，故提出的物质只能称粗脂肪。
三、步 骤
样品的准备
将样品在80度烘箱内烘去水分，烘干时需避免过热，冷却后准确地称取1克左右放入
研钵中研碎，再用滤纸将样品包裹好放入索氏提取管内。注意勿使纸包内样品高于提取管的虹吸部分，研磨后的研钵应用滤纸擦净并将滤纸放入提取管内，用少量溶剂洗涤研钵，将溶剂倒入提取管中。 1.抽提
洗净提取瓶于105℃烘干至恒重，冷却后准确称重，并记录瓶重。装入石油醚达提取瓶容积的一半，连接提取器各部分，不能漏气（不能用凡士林或真空脂）。 2.加热提取
精密称取待测样品2g（A），用滤纸包好，放入浸提管内，纸包长度不能超过虹吸管高度。于已称重的小烧瓶内倒入1/2-1/3体积的石油醚（其量应略大于浸提管内体积），联接索取器各部分（不能涂凡士林）。置约70℃恒温水浴锅内（水必须是蒸馏水或置于电热板上）控制加热温度，使每小时回馏3－5次较宜，一般提取10小时左右。 4.称重
提取完毕，待石油醚完全流入小烧瓶时取滤纸包，再回馏一次以洗涤浸提管。继续加热，待浸提管内石油醚面接近虹吸管上端而末流小烧瓶前，倒出浸提管中的石油醚，如果小烧瓶中尚留石油醚，则继续加热蒸发，直至小烧瓶中溶剂基本蒸完。停止加热，取下小烧瓶，用吹风机在通风橱中将瓶中残留石油醚吹尽。再置103－105℃烘箱中烘半小时，取出冷却后立即称重。 将提取瓶中的石油醚全部蒸干，洗净外壁，置于105℃烘箱中干燥至恒重，再把瓶中脂肪倒出，洗净，烘干，并恒重称重，然后按下式计算粗脂肪百分含量。
量（克）－提取瓶的重量（克）粗脂肪（100％）＝提取瓶及瓶中脂肪的重×100％
样品重量（克）
也可以按照下式较简易的计算
粗脂肪（100％）＝纸包的重量－烘干纸包的重量×100％
芝麻的重量
四、器材与试剂
1.器材：天平，索氏脂肪提取管，恒温水浴锅，滤纸。 2.试剂：石油醚（30－60℃）。
五、实验报告
计算所测材料中的粗脂肪含量,记录实验中发生虹细的时间,进行比较总结规律,并比较不同种类的样品的脂肪提取率,与通过从资料中查到的脂肪含量进行比较。从中进行总结。
六、思考题
1. 哪些种子的粗脂肪含量较高？ 2. 写出四、五种良好的脂肪溶剂.
3. 查阅生化类教科书，写出几种脂溶性维生素。
实验二 蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法
一、 目的要求
1、熟悉 721型分光光度计的原理及使用方法。
2、学习考马斯亮蓝 (Coomssie Brilliant B1ue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
二、721分光光度计的使用 分光分析原理
有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。
分光分析法常用于测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert- Beer定律。
（一）Lambert定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度(C)不变则液层的厚度(L)愈大，光线强度的减弱也愈显著。
若C不变， OD ∝ L
（二） Beer定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，若液层的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著。
若L不变： OD ∝ C
（三）Lambert-Beer 定律及其应用 1．Lambert-Beer 定律：
当一束单色光通过一均匀溶液时，该溶液对光吸收的程度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。其关系式如下：
I—
T= =10KCL
I0
两边取对数得：lgT=–KCL
I0 C I L 图6 一束单色光通过溶液时的情况示意图
式中T为透光度，I0为入射光强度，I为透过光的强度，C为溶液的浓度，
L为液层的厚度。K为常数，称为消光系数，其数值与物质种类、光线波长和溶液温度有关。
I–lg 若将 用光密度（OD）表示该溶液对光线吸收的情况（有的也用吸光度A表示），
I0 则它们之间的关系如下：
2．待测溶液浓度的计算： I0
I
OD（或A）=–lg =–lgT=KCL
根据Lambert-Beer定律 标准溶液：ODs=KsCsLs
待测溶液：ODu=KuCuLu
当两种溶液的液层厚度相等（Lu = Ls）、温度相同、且波长也相同（相同物质的两种不同浓度）时，则Ku=Ks。
两式相比得：
即：
ODs ODu
= Cs Cu
Cu= ×Cs
ODs
ODu
721E型分光光度计的操作
这是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计。其波长范围为360-800nm，在410-710nm之间的灵敏度较好。
使用方法如下：
1. 转动波长选择钮，选用所需的波长。 2. 接通电源（指示灯亮），打开电源开关。 3. 将机器预热20分钟。
4. 按动“Mode”键，模式转换到“T”模式。
5. 拉动比色皿座的拉杆半格，使隔板正好档住光路，按“0％T”按钮调0，然后将拉杆推回。
6. 按“100％T”按钮调节“100％T”，此时显示屏出现“BLA”字样，闪烁几秒后出现“100.0”,调节完毕。
⒎将比色皿放入，空白对照放入第一格，重复步骤六以后，将模式转化为“A“模式，测定溶液的吸光度。做标准曲线时从低浓度往高浓度过渡时不需要用蒸馏水润洗比色皿。
⒏比色完毕后，关上电源开关，取出比色皿，将比色皿暗箱盖好，清洗比色皿并晾干。
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质—染料结合的原理浓度的快速。灵敏的方法。
考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式．红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键(vsn der Waals’bond)结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’slaw)。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量．
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质—染料复合物具有很高的消光系数．使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5pg时就有0．275光吸收值的变化，比lowry法灵短4倍，测定范围为10一1000ug蛋白质，微量测定法测定范围是1—10ug蛋白质。此反应重复性好．精确度高，线性关系好．标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重合，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低．但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgC12，乙醇，(N4H)2S04无干扰．强碱缓冲剂