在测定中有一些颜色于扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响．Tris，乙酸，2—巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X—100,SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污刑的存在对颜色影响太大而不易消除。
四、试剂与器材
㈠试剂
1．考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50mL95％乙醇中，加入100mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01％(W/V)考马斯亮蓝G—250，4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V)磷酸。 2．标准蛋白质溶液
结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg／mL蛋白溶液。 ㈡测试样品
未知蛋白质溶液。 ㈢器材
试管、试管架、移液管(5mL)，微量取液器，721型分光光度计
五、操作方法
㈠标准法制定标准曲线
取14支试管．分两组按下表平行操作
表8 考马斯亮蓝标准曲线制作方法
试管编号 0 1 0.02 0.08 2 0.03 0.07 3 0.04 0.06 5 4 0.05 0.05 5 0.06 0.04 6 0.07 0.03 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝试剂/ml 0.10 摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 A595nm
绘制标准曲线：以595nm为纵坐标．标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲
线。
㈡测定未知样品蛋白质浓度
测定方法同上，取合适的未知样品体积。使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。
六、注意事项
(1)如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5—20min血内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。
(2)测定中，蛋白—染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的，测定完后可用乙醇将蓝色的比色皿洗干净。
实验三 蛋白质的两性性质及等电点的测定
一、 实验目的：
（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。 （2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、 实验原理：
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N－端α－氨基与C－端α－羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：
COOH++H+COO-CNH+H N3CRHOH-H+COO-H N2CNHH OH-H N3H阳离子 两性离子 阴离子 pH < pI pH = pI pH > pI 电场中： 移向阴极 不移动 移向阳极
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白
质的等电点。
三、 实验设备与器材：
仪器：
试管架，试管：15ml×6，刻度吸管：1ml×4，2ml×4，10ml×2，胶头吸管×2 试剂：
1、 1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。 2、0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。 3、0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。
4、0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/L NaOH 10ml，加水至50ml,配成0.2mol/L NaOH。
5、0.2mol/L盐酸：吸取37.2%（比重1.19）盐酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L盐酸。然后吸取1mol/L盐酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L盐酸。
6、0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29ml 1mol/L NaOH，然后加水至50ml。 7、0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入约20ml水，再准确加入1mol/L NaOH 5ml，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀释定容至50ml，充分摇匀。
四、 实验内容与步骤：
一、蛋白质的两性反应
（1）取一支试管，加0.5%酪蛋白3ml，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。
（2）用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，边加边摇直到有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。 （4）滴加0.2mol/L NaOH 进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH，沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。
二、酪蛋白等电点的测定
（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂： 试剂（ml） 1.0mol/L 乙酸 0.1mol/L 乙酸 0.01mol/L 乙酸 H2O 溶液的pH 管号 1 1.6 0 0 2.4 3.5 2 0.8 0 0 3.2 3.8 3 0 4 0 0 4.1 4 0 1 0 3 4.7 5 0 0 2.5 1.5 5.3 6 0 0 1.25 2.75 5.6 7 0 0 0.62 3.38 5.9 （2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。
（3）用－、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。
【注意事项】
缓冲液的pH值必须准确。
五、 思考题：
1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。 2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
实验四 盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
一、目的与要求
⑴学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 ⑵掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯配胺(acrylamide，简称Acr)和双体(或交联剂)N，N’－甲叉双丙烯酰胺(methylene—bisacry—1amide，简称Bis)在催化剂和加速剂的作用下聚合交联成的三维网状结构凝胶。凡以此凝胶为支持物的电泳均称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis)。
聚丙烯酰胺是由丙烯酰肤和甲叉双丙烯酰脓在催化剂过硫酸胺或核黄素和加速剂N，N，////
N，N四甲基乙二胺(N，N，—N，Ntetramethyl ethylene diamine，简称TEMED)的作用下，聚合而成的。按其催化体系可将此聚合反应分为两类：
第一类，过硫酸胺—TEMED体系，又称为化学聚合，TEMED催化过硫酸胶水溶液产生出游离氧原子，然后激活单体，形成单体长链，在交联剂的作用下聚合成凝胶，在碱性条件下凝胶易聚合，其聚合速度与过硫酸胺浓度的平方根成正比。此法制得的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶。
第二类，核黄素TEMED体系：此为光聚合作用。光聚合作用.通常需痕量氧原于存在才能发生，核黄素在TEMED及光照条件下还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基．从而引发聚合作用。过量氧会阻止链的增长。该法主要用于制备孔径大的凝胶。核黄素对活性物质的影响较小。
控制凝胶总浓度及交联度可以得到合适性能及孔径的凝胶。在操作时可根据被分离物的分子量大小选择所需凝胶的浓度范围。通常以7.5％凝胶作标准胶，一般可获得较满意的效果。
聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应可分为连续及不连续系统。在连续系统中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电荷及分子筛效应得以分离，在不连续系统中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度均不连续，带电颗粒在电场中泳动不仅
有电荷效应和分子筛效应，还具浓缩效应，具有良好的清晰度及分辨率。按器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。
⒈样品浓缩效应
⑴凝胶孔径不连续性：在不连续圆盘PAGE中．凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成，前者孔径大，后者孔径小，在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢，因而在二层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：在二层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(简称Tris)及Hcl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HCl在任何pH
-值溶液中均易解离出氯离子(Cl)，它在电场中迁移率快，走在最前面故称为快离子或前导
-离子。在电极缓冲液中的甘氨酸(G1y)在pH8.3的环境中易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中其解离度很小、仅有0.1％一1％．因而在电场中迁移很慢，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷．在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快、慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。三者的有效迁移率顺序为：m氮a氮﹥m蛋白a蛋白﹥m甘a甘(m为迁移率，a为解离度)，当进入pH8.9的分离胶时．甘氨酸解离度增加，其有效迁移
--率超过蛋白质，因此Cl及NH2CH2COO沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面、然后再分成多个区带，因此浓缩胶与分离胶之间pH的不连续性是为了控制其有效迁移率。在浓缩胶中要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品在快、慢离子界面之间被浓缩。进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。 (3)电位梯度的不连续性：电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关(v＝mE)。迁移率低的离子在高电位梯度中可以与迁移率高而处于低电位梯度的离子具有相似的速度，在不连续系统中．电位梯度的差异是自动形成的，电泳开始后由于快离子迁移率最大，就会很快超过蛋白质．在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区。低电导区就具较高的电位梯度，而高的电位梯度又使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，三者的泳动速度就相等。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳态建立后，二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面，即在高、低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。由于蛋白质的有效迁移率恰好位于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动界面附近，被压缩成一个狭小的中间层。 2．分子筛效应
分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即分子筛效应。经过浓缩胶的浓缩效应后，快、慢离子及蛋白质均进入pH8.9的同一孔径的分离胶中，此时高电压消失，在均一的电位梯度下．由于G1y解离度增加，加之分子量较小，其有效迁移率增加，赶上并超过各种血清蛋白质。在同一孔径的凝胶中各种血清蛋白分于迁移速度与分子量大小和形状密切相关，分子量小且为球形的蛋白所受阻力小．移动快，走在前面，反之阻力大，移动慢，走在后面。从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自区带。 3.电荷效应 ·
进入pH8．9的分离胶后，各种血清蛋白所带净电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快；反之则慢。 因此各种蛋白质按电荷多少，分子量大小及分子形状以一定顺序排列成一个个圆盘状的区带。此称为圆盘电泳。
PAGE的连续电泳也有很广的应用范围，但无浓缩效应，主要利用分子筛效应和电荷效应