进行分离，其条件温和，对生物活性的保持有益。
聚丙烯酷胺凝胶作为支持介质有一系列优点：在合适的浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械性能好，化学性能稳定，与被分离物质不起反应，几乎无电渗作用；凝胶孔径可调节；分辨率高。目前在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及小量制备、分子量测定、等电点测定等诸多领域广泛采用PAGE。
三、试剂
⒈新鲜不溶血的动物血清
⒉凝胶缓冲液(pH8．9)；取Tris36．6g，TEMED0.23ml,加1mol/L HCl48m1，再加重蒸水
至80m1，溶解，调pH8.9,然后加重蒸水至100m1。棕色瓶4℃保存。 ⒊分离胶溶液(28％Acr—O.735％Bis)：取28.0g丙烯酰胺和0.735g甲叉双丙烯酷肢，加
重蒸水使其溶解后定容至100m1，过滤后置棕色瓶4℃保存。
⒋浓缩胶缓冲液(pH6．7)：取5．98gTris，0．46m1TEMED和48m1 1mo1／L HCl，加重蒸水至80mI调pH值至6．7后定容到100mI，棕色瓶4℃保存。
⒌浓缩胶贮液：取10.0g Acr和2.5gBis，加重蒸馏水溶解后定容到100m1，滤后置棕色瓶4℃保存。
⒍过硫酸胺溶液： 取分析纯过硫酸胺（AP）0.14g用重蒸馏水定容到100m1．棕色瓶4℃保存，当天用当天配制。
⒎核黄素溶液：取4.0mg核黄素用重蒸水定容到100ml，棕色瓶4℃保存。 ⒏40％蔗糖溶液(W／V)。 ⒐Tris·甘氨酸电极缓冲液(pH8．3)，取6.0gTris甘氨酸28.8g加重蒸水至90ml，调pH8.3后定容至100m1，4℃保存。用前稀释10倍。（？） ⒑0.1％溴酚蓝指示剂。
四、操作方法
⒈安装圆形玻管
取玻璃管洗净烘干后将其下端口用Parafilm三层或橡胶玻璃头封严，然后垂直安放在试管架上备用，或直接插于电泳槽内。 2．配胶
分离胶的配制比例为pH8.9的分离胶缓冲液2.50m1，28％凝胶贮液5.00ml，重蒸水2.50m1，0.14％AP10ml。加AP前需充分混匀，置真空干燥器中抽气10分钟。分离胶的终浓度为7％，终体积为20ml。
浓缩胶的配法：取浓缩胶缓冲液(PH6.7)1m1，浓缩胶贮液2m1，40％蔗糖4m1，0.004％核黄素溶液1m1，加核黄素液之前需充分混匀，置真空干燥器中抽气l0分钟，所配浓缩胶浓度为2.5％，终体积为8ml。 3．灌胶
不连续体系凝胶的灌注分两步。分离胶的制备：混合好的凝胶溶液用细长头滴管加至准备好的玻管内，加胶高度距上端口2cm左右，用lml注射器在凝胶表面轻轻加—层重蒸水(沿管壁)，约3—5mm，用于隔绝空气，使胶面平整。30一60分钟后凝胶完全聚合，此时可见水与凝胶面有折射率不同的界线出现。用滤纸条吸去多余水分，勿碰胶面。
浓缩胶的制备：混合好的浓缩胶溶液用细长头滴管加到分离胶的上面，使其液面距上端口约0.5cm然后置于日光灯(10cm远)或阳光下照射进行光聚合。注意温度不能太高，凝胶由淡黄色变成乳白色表明聚合作用开始，继续光照半小时，聚合即可完成。而后继续放置
30一60分钟，用滤纸条吸去多余水分。 4．加样、电泳
持制备好的凝胶玻管插入圆盘电泳槽上，加少许电极缓冲液检查一下是否有渗漏现象，若有解决之。然后在上下极槽内加人适量的电极缓冲液，使上下极电路畅通。然后加血清蛋白样品(血清：40％蔗糖按1;1混匀，再加少许溴酚蓝)5—10μl，加样时用微量注射器将样液通过缓冲液小心地加在凝胶表面，将所有玻管内均加完样品后即可开始电泳。按上槽接负极、下槽接正极的方式接到直流稳压电泳仪上，开始电泳，电流按lmA／管，当样品进入分离胶时，将电流调至3mA／管。当染料移至距下端1cm时，将电流调回至零，关电源。分别收集上下极槽电泳缓冲掖，4℃保存，还可再用。
5．固定染色
取出玻管，用注射器吸满自来水后特长针头插到凝胶与管壁之间，推动注射器，同时转动玻管，使针头在管壁与胶之间前进，胶条在水的压力及滑润作用下自玻管中脱出。然后将于净的胶条浸泡在氨基黑10B染液中，染色10分钟，同时也进行了固定。 6．脱色
用水冲去胶条表面染料，置于7％乙酸中浸泡漂洗，更换醋酸液数次，直到背景色脱去。脱色液经活性炭脱色可再利用。也可在50℃水浴中或脱色摇床上进行脱色。 7．将结果绘出成保存实物，注意电泳方向。
五、说明
1．本电泳也可采用连续凝胶系统。其7％凝胶溶液的配比为分离胶缓冲液(pH8.9)：凝胶贮液；水；0.14％AP＝1：2：1：4，前三者混合后抽气，再与抽过气的AP液混匀，然后灌胶。 2．本实验的方法同样可用于聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，该法具有板型薄、易冷却、分辨率高、便于比较和扫描等优点。
3．电泳中在样品中的盐浓度应尽量低，否则有施尾现象，可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不超过l00μg蛋白／l00μl。
4．在不连续电泳中，在分离胶聚合后可进行预电泳(1mA／管，1小时)，洗净胶面后才能灌制浓缩胶。
5．在电泳时所有凝胶试剂应选用高纯度试剂，否则会影响胶的聚合和电泳效果。 ’
丙烯酰胺的纯化：取70gAcr溶于1000ml50℃预热的氯仿中，溶解后趁热过滤，冷却后至一20℃低温冰箱中，则有白色结晶析出，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集白色结晶，再用预冷的氯仿淋洗几次，真空干燥后置棕色瓶中密封保存。
甲叉双丙烯酰胺的纯化：取12gBis，溶于1000m1预热40—50℃的丙酮中，趁热过滤，冷却后至一20℃低温冰箱中，待结晶析出后，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集结晶、用预冷丙酮洗涤数次，真空干燥后置棕色瓶中密封保存。
Acr、Bis的贮液会发生分解；一船仅能保存1—2个月，纯Acr水溶液pH为4．9—5．2，pH值变化不大于0.4pH单位时能使用。Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时宜戴手套和口罩，纯化应在通风柜内进行。
实验五 多酚氧化酶的制备和性质研究
一、目的
⒈学习从组织细胞中制备酶的一般方法
⒉学习多酚氧化酶的作用特性及影响多酚氧化酶作用的因素
二、原理
多氧化物酶是一种含铜的酶，广泛存在于各种组织如鲜蘑菇、土豆和水果中。土豆、水果去皮后表面变成褐色就是由于该酶作用的结果。由多酚氧化酶催化的反应（以邻苯二酚为例）可用下式表示：
多酚氧化酶作用的最适pH为6～7，最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）；间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，他们也可被氧化为相应的醌类化合物。因此，由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液颜色的变化鉴定。
细胞环境中的各种因素直接影响酶的催化活性，因为酶是生物催化剂。要研究某一种因素对于酶催化反应的影响时，仅在被研究的因素呈变化的情况下，测定它对于反应速度的影响，而其他的实验条件应保持一致。
三、材料
1）土豆
2）高速组织捣碎机
3）烧杯（100mL） 4）平纹布或纱布 5）试管及试管架 6）恒温水浴 7）小刀
8）移液管（2mL、5mL、10mL）
四、试剂
⑴0.1mol/L的氟化钠（NaF）溶液：把4.2gNaF溶于1000mL水中。
⑵0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用1％的氢氧化钠调节溶液的pH为6.0 。新鲜配制，并储存于棕色瓶中。 ⑶柠檬酸缓冲液（0.05mol/L,Ph4.8） ⑷5%的三氯乙酸溶液 ⑸苯硫脲（结晶）
⑹0.01mol/L的间苯二酚溶液 ⑺0.01mol/L的对苯二酚溶液 ⑻饱和硫酸铵溶液
⑼0.96％的盐酸：把9.6mL浓盐酸加水稀释至1L ⑽0.1%的乳酸溶液（100mL水中含有0.1mL的乳酸） ⑾0.5％的碳酸钠溶液 ⑿0.01％的碳酸钠溶液
五、操作步骤
⒈多酚氧化酶的制备
⑴拿一块土豆，洗去上面的泥土 ⑵把土豆削皮后切成小块
⑶称取100g小块土豆，立即加入氟化钠溶液100mL，放入组织捣碎机中研磨30s，（此步最好6个同学一起做，上述用量乘6） ⑷把匀浆物通过几层纱布过滤
⑸取50mL滤液（注：滤液应无色，若为红色应重新匀浆提取），加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4℃放置30min，可见有白色沉淀产生。
⑹将上层清夜倒出一部分（若离心管容量允许，可不必倒出部分上清），其余部分在4000r/min下离心15min，倒掉上清，保留沉淀物。
⑺将沉淀物用大约20mL柠檬酸缓冲液溶解，在4000r/min下离心20min，上清即为酶提取液。
⒉多酚氧化酶的作用
⑴将三支干净的试管，分别编号为1、2和3 ⑵按下面的要求制备各管
管1：加15滴酶抽提液和15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液，混合均匀 管2：加入15滴酶抽提液和15滴水，混合均匀
管3：加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液、15滴水，混合均匀
⑶把三支试管放于37℃水浴上，每隔5in振荡试管，并观察每管中溶液颜色的变化，记录入下表，共反应25min。
表 12 三管反应比较
反应时间/min 0 5 10 15 20 25
管1 管2 管3 ⒊多酚氧化酶的化学性质
⑴取三支试管，分别编号为1、2和3
⑵向管1中加入15滴酶抽提液和15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液，振荡混合放于37℃水浴中10min
⑶向管2中加入15滴酶抽提液和10滴5％的三氯乙酸，混合均匀，放置2min，再加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液。混合均匀放于37℃水浴中10min，观察颜色变化。 ⑷向管3中加入15滴酶抽提液和少量苯硫脲结晶，充分混合，再加入15滴邻苯二酚溶液。将试管放入37℃水浴中10min，观察溶液颜色的变化。