通过大量实验摸索得到的DNA 样品制备流程如下。
①用4次蒸馏水将原始DNA 样品稀释至2ng Πμl ,且在涡旋震荡器上震荡1min 使样品在溶液中分散均匀;
②取5μl 的样品滴于APS 2云母上,并用封口膜覆盖在上面,沉积5min ;
③用4次蒸馏水冲洗约15次,每次水的体积在200μl 左右效果最好;
④放置在空气中约4h 以上后进行观测。图1是按照上述样品制备流程得到的AFM 图像。展示了APS 2云母上制样的三种情况。图1a 中DNA 分子的形态很正常但数量太少,不适合做统计
分析;图1c 中虽然DNA 分子数量很多,但是DNA 分子自身扭曲且分布不均匀,无法进行长度测量;图1b 中DNA 分子无论在形态还是数量上都合适,分散也比较均匀,适合进行长度测量和大量统计分析的研究,其中斜线为电子学噪声,并不影响观测。相同的制样流程却出现以上三种不同的现象,根本原因在于APS 2云母的吸附力强弱存在很大差别。为了满足不同的实验目的,需要吸附力强弱不同的APS 2云母。例如,图1a 所示的APS 2云母适合单分子
的操纵,而图1c 所示的APS 2云母则适合做强吸附的实验,只有图1b 所示的APS 2云母适合我们的实验。但是,APS 2云母吸附力的强弱又很难把握,为我们的研究带来巨大的困难,同时也迫使我们去探索另外一种新的制样方式2纯云母上的DNA 样品制备。图1 质粒DNA 在APS 2云母上的图像。扫描范围:6μm ×6μm Fig.1 Images of plasmid DNA deposited on APS 2mica.Scan size :6μm ×6μm
212 在纯云母上的DNA 制样研究
采取分三步走的研究思路:首先,把DNA 浓度固定调节Mg 2+
浓度并找到最佳值;其次,固定Mg 2+
浓度调节DNA 浓度找到最佳值;最后,调节吸附时
间以及冲洗次数等细节问题,完善制样流程。
21211 Mg 2+
浓度的确定
首先,根据在APS 2云母上的经验,把DNA 浓度
固定在1ng Πμl ,然后调节Mg 2+
浓度来筛选最合适的
浓度值。图2是在不同的Mg 2+
浓度下得到的AFM 图像。
图2a 中DNA 分子发生凝聚现象,说明Mg 2+
浓度太大,以至于DNA 分子相互结合在一起不能均匀地分散在云母上;图2b 中DNA 分子则相互交联形
成DNA 的网格结构,对于这种现象Aiguo [14]
和
Malinovskis 等[19]
也进行了相关研究;图2c 中DNA 分
子之间交联随着Mg 2+
浓度的减小已经消失,但是DNA 分子自身的扭曲还存在;图2d 中可以看到DNA 分子正常的超螺旋形态,但由于冲洗过程水流
的影响使DNA 分子有明显分子取向,还需要进一步改善。21212 DNA 浓度的确定把Mg 2+
浓度固定在1mm ol ΠL ,然后调节DNA 浓度,筛选最合适的浓度值。图3是在不同的
DNA 浓度下得到的AFM 图像。
从图3中的3张图像可以看到,图3a 中DNA 的数量太少,对于要做大量统计的实验不利;而图3c 中DNA 又太多以至于不同分子之间有重叠,对长度测量也不合适;图3b 则无论在形态表现还是数量分布上都非常理想,完全满足我们的实验要求。21213 改善细节问题,完善制样流程
通过前两步可以确定DNA 浓度为1ng Πμl ,Mg 2+
的浓度为1mm ol ΠL 的制样最理想,再调整冲洗及吸
附时间等细节总结出以下样品制备流程。
①用4次蒸馏水和MgCl 2溶液将原始DNA 样品稀释成DNA 浓度为1ng Πμl ,Mg 2+
浓度为1mm ol ΠL
的溶液;
②在涡旋震荡器上震荡2～3min 使样品在溶液中分散均匀;
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7第1期蔡明辉等:AF M 的DNA 样品制备技术研究 © 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.77cn.com.cn