４ ．种子的扩大培养
种子的扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种，
接入试管斜面活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的 纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。
（１）种子必须具备的条件
①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长。 ②生理性状稳定。
③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求。 ④无杂菌污染（不带杂菌） 。 ⑤生产能力稳定。 （２）种子扩大培养的目的
①提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。缩短发酵周期，降低能耗，减少染菌的机
会。
②让菌种从固试管、液体试管… …逐步适应。
③菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。 （３）工业微生物菌种培养的类型
由于培养目的的不同，微生物的特性不同，在微生物培养中应采用不同的培养方法。 根据菌对氧气的需求不同，有好氧培养和厌氧培养；根据培养基质的不同，有固体培养 和液体培养；根据培养是否连续，有分批培养和连续培养。现将培养方法及特点简述如下：
①种子扩大培养阶段
A．液体培养法：包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇 瓶机型式、转数、振程（或偏心距） 、三角瓶容量、装料量有关。
B．表面法培养：包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。
C．固态法培养：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。 ②大规模生产阶段
工业生产中，由于培养基数量大，微生物细胞食粮要求多，因而培养方法与种子培养阶 段有所不同。生产上常用的培养方法有浅盘固体培养、深层固体培养、浅盘液体培养、深层 液体通气培养等方法。现将主要方法介绍如下：
A．固体培养：在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄 地摊铺在容器的表面，这样，既可使菌体获得充足的氧气，又可将生长过程中产生的热量及 时释放，这就是传统的曲法培养的原理。
固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮等。将麸皮和水混合，必要时添加一些辅助 营养物和缓冲剂，灭菌后待冷却到适合温度后就可接种。接种时用的种子可通过逐级扩大培 养获得。
B．液体培养：液体培养生产效率较高，适于机械化、自动化，因而是目前微生物发酵 工业的主要生产方式。有浅盘培养和液体深层通气培养两种类型：
a．浅盘培养：容器中盛装浅层液体静止培养，没有通气搅拌设备，全靠液体表面与空 气接触进行氧气交换，这是最原始的液体培养方式。其劳动强度大，生产效率低，易污染。
b．液体深层培养：液体深层培养是在发酵罐内进行的。发酵罐内装有搅拌器，空气从 罐底部通入，送入的空气在灌内的搅拌器的搅拌下分散成微小气泡以促进氧的溶解，这种培养方法称为深层培养。
第三节 发酵操作方法和工艺控制
一、发酵操作方法 如下几个
指标：
（１）底物转化为产品的比率，按比率就能够确定原料对产品成本的影响。 （２）产率，即发酵罐在单位时间内、单位体积内制造的成品和半成品的数量。 （３）发酵产物的浓度，据此就能够确定一个提取和精制的费用。 （４）残留底物量，据此确定实际的转化率和防治杂菌的费用。
微生物的工业发酵方式有多种 多样，但发酵过程 是很类似的，其 基本步骤如图２唱３所 示，目前比较成熟的工艺有
酵三种类型。
１ ．分批发酵
分批发酵、连续发酵和补料发
营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外 部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程，它除了控制温度和pH及通气以外，不 进行任何其他控制，操作简单。但从细胞所处的环境来看，则明显改变，发酵初期营养物过 多可能抑制微生物的生长，而发酵的中后期可能又因为营养物减少而降低培养效率，从细胞 的增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也长不快， 总的生产能力不是很高。
其
优点是：对温度的要求低，工艺操作简单；比较容易解决杂菌污染和菌种退化等 问
题；对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。
缺点是：人力、物力、动力消耗较大；生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生
长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发 酵、设备冲洗、灭菌等阶段；生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中 代谢产物的g数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时 间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。
四个阶段
（１）延迟期（适应期） （２）指数生长期 （３）稳定期（４）衰亡期２ ．连续发酵
所谓连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出 培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地 延长分批培养中的对数期。在稳定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物浓度、产物 浓度、p H等都能保持恒定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变，甚至还可以 根据需要来调节生长速度。连续发酵的具体操作如图２唱５所示。优点
与分批发酵相比，连续发酵具有以下：
（１）可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相
应保持稳定。
（２）能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和 毒性产物接触的机会。
（３）减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工 时。
（４）由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长。
（５）容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率。缺点 当然，它也存在一些
：
（１）由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染。 （２）在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异。 （３）对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高。
（４）粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵操作带来困 难。
３ ．补料分批发酵
运用补料分批发酵技术进行生产和研究的范围十分广泛，包括单细胞蛋白、氨基酸、生 长激素、抗生素、维生素、酶制剂、有机溶剂、有机酸、核苷酸、高聚物等，几乎遍及整个发酵行业。４ ．固态发酵
二、影响发酵的主要因素（论述题）
在发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样 测定或进行连续测量。反映发酵过程变化的参数可分两类：一类是可以直接采用特定的传感 器检测的参数。它们包括反映物理环境和化学环境变化的参数，如温度、压力、搅拌功率、 转速、泡沫、发酵液粘度、浊度、p H、离子浓度、溶解氧、基质浓度等，称为直 接 参数。 另一类是至今尚难于用传感器来检测的参数，包括细胞生长速率、产物合成速率和呼吸熵 等。这些参数需要根据一些直接检测出来的参数，借助于电脑计算和特定的数学模型才能得 到。因此，这类参数被称为间接参数。上述参数中，对发酵过程影响较大的有温度、p H、 溶解氧浓度、泡沫等。
1.温度 2.pH p H对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：
（１）影响酶的活性，当p H抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢。 （２）影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质 的吸收及代谢产物的排泄。
·
（３）影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。 （４）pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
3.溶解氧
４．泡沫。
第五节 发酵工程的应用
一、氨基酸的生产工艺
如谷氨酸钠、肌苷酸钠、鸟苷酸钠可作为鲜味剂，色氨酸和甘氨酸可作为甜味剂。
注意：从发酵液中提取出来的谷氨酸，是味精生产过程的半成品，还需要经过中和、脱色、真
空煮晶、分离、干燥等操作才能制成味鲜透明、晶莹洁白的成品味精。
第三章 细胞工程
第一节 细胞工程概述
一、细胞工程
二、细胞工程发展过程简介
所谓细胞工程，就是应用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞水平进行的遗传 操 作。
在１９６５年
哈里斯和沃特金斯的经典工作发表之前，科学家们只能在不同小鼠细
胞之间观察通过细胞融合而实现的细胞杂交现象。哈里斯和沃特金斯的工作，则大大地拓展
灭活的病毒在控制的条件下可
以用来诱导动物细胞的融合；亲缘关系较远的不同种的动物细胞之间，也可以被诱导融合；形成的融合细胞在适宜的条件下，可以继续存活下去。
了细胞融合的研究范围。他们的贡献在于证明了：
植物原生质体之所以能成为植物细胞工程的理想研究材料，是因为它具有以下重要
特
点：
（１）易于从同一种植物材料的组织中获得大量的遗传上同一的游离原生质体，为植物细 胞的遗传操作的微生物化奠定了基础。
（２）可以像动物细胞一样，被诱导与其他物种的原生质体融合，从而有效地克服了不同 物种细胞之间的有性不亲和障碍，为实现远缘物种间的体细胞杂交，培育新种提供了新的手段。
（３）它既可以捕获外源DN A，也可以捕获较大的细胞器，如病毒颗粒、叶绿体、线粒体等，因而是植物遗传转化的理想受体。
（４）保持着植物细胞的全能性，在适宜的培养条件下，可以重新长出细胞壁，进行细胞 分裂、分化，形成完整的小植株。
（５）植物原生质体虽然没有细胞壁，但仍然进行着植物细胞的各种生命活动，包括蛋白 质和核酸的合成、光合作用、呼吸作用、通过膜向外界进行物质交换等。
第二节 细胞工程的基本技术
一、细胞培养技术
（1）植物细胞培养的基本过程包括如下几个步骤： ①从健
康植株的特定部位或组织，如根、
茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。 ②用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠、升汞和酒精等对外植体表面消毒，建立无菌培
养体系。严格控制无菌条件，这是获得培养成功的重要一步。 ③形成愈伤组织和器官，外植 体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株。另一 途径是用外植体或愈伤组织细胞经液体悬浮培养诱导胚状体再长成植株。胚状体的形成可大 大提高繁殖效率，并可减少变异。
（２）动物细胞培养有两种方式：一种叫非贴壁培养。这种方法一般是用
于血液、淋巴细
胞、肿瘤细胞，包括杂交瘤细胞和一些转化细胞的培养。这类细胞也可采用微生物培养方式 进行悬浮培养。另一种培养方式是贴壁培养。大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许 多异倍体体系细胞，多采用附着于带适量正电荷的固体或半固体表面进行培养。
动物细胞培养的主要步骤如下： ①从健康动物体内，无菌条件下取出适量组织，
剪切成
小薄片。 ②加入适宜浓度的胰蛋白酶或胶原纤维酶与ED T A等进行消化作 用使细胞分散。③将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以２ ～ ７ × １０ 细胞／m L的浓度加在培养基中， 下进
行原代培养，并适时进行传代培养。
二、细胞融合技术
３７ ℃
（重点）
特点： ①可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子的
细胞融合又称为体细胞杂交 １ ．植物细胞融合植物细胞融合具有以下
不亲和性； ②可获得含有另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广； ③一次操作可实现两个以上亲本的融合作用； ④可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； ⑤ 可形成有性生殖障碍植物种间杂种。
动物细胞融合与植物细胞融合的原理和步骤基本是相似的，只是植物细胞融合必须先制 备原生质体。现以植物为例介绍其主要步骤：
植物细胞融合的基本过程包括细胞分离、原生质体制备、促融因素诱导、原生质体 融 合、杂种细胞筛选及鉴定，然后通过愈伤组织诱导分化出根、茎、叶，最后长成完整的体细 胞杂种植株。
（１）原生质体的选择与制备
用于细胞融合的原生质体必须具备的特点： ①制备的原生质体活力要强，遗传上要 一致； ②原生质体双亲中至少有一方具有诱导原生质体再生成完整植株的成熟技术； ③原生 质体应带有可供融合后识别异核体的性状，如颜色、核型及染色体差异等； ④在异核体发育 中具有可用于杂种选择的标记性状，如营养突变体或对药物敏感等，最好两亲本的标记性状 互补。
制备原生质体材料有时需预处理，②
预培养，将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养７天，再用酶消化脱壁，所得的 原生质体分裂频率较高； ③暗处理，将室温下 生长５ ～ ７个 星 期 的植 物材 料 于 黑暗 中 放 置 ３０h以上，可增强原生质体的活力； ④光处 理，将叶片于日光 或灯光下照射２ ～ ６h令其 萎 蔫，有利于撕下表皮及原生质体分离。
高等植物的细胞壁的主要成分是
预处理的方法有： ①预质壁分离，将愈伤组织或悬浮
培养细胞置于１７ ～ ２０ ℃酶液中静置半小时，再于２８ ～ ３４ ℃保温以达到质壁分离的目的；
质。因此，常 用
α唱纤维素和半纤维素、果胶质及蛋白