的消化植物细胞壁的酶类有纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、半纤维素酶、蜗牛酶。
（２）促融因素
原生质体自发融合的效率很低，必须采用人工诱导的方法才能实现有效的融合。诱导方 法大致分为物理方法和化学方法两类。物理方法主要采用显微操作、离心振荡和电场诱导 等；化学方法主要是采用促融剂，常用的有聚乙二醇（PEG）法、NaN O３融 合法、高p H 高Ca
法、电融合法，还有多聚化合物法。
（３）融合过程
以PEG诱导融合为例，基本的操作过程是：将来源不同的亲本的原生质体等体积混合， 调整原生质体的浓度为２ × １０ ／m L，然后按每滴０畅 １m L的量滴于６cm的平皿中，每皿７ ～ ８ 滴，静置１５min，令原生质体贴于皿底，然后向每滴原生质体滴加０畅 １mL３０ ％的PEG溶液，
（４）杂种细胞的筛选 原生质体融合后将产生有原亲本细胞、两亲本细胞的同源融合体、两亲本细胞的异源融 合体组成的混合物，因而需要通过培养与筛选除去不需要的细胞，分离出杂种细胞。其筛选 方法可分为互补选择法和机械选择法。
①互补选择法：是利用两个亲本具有不同的生理或遗传特性，在形成杂种细胞时产生互 补作用的原理进行筛选的方法。此法还可以分为基因互补筛选法、抗性互补筛选法、营养互
补筛选法、白化互补筛选法、激素互补筛选法等。
②机械选择法：也称为机械分离法。是根据双亲原生质体在颜色上的差别而进行选择的 方法。此法还可以分为天然颜色标记分离法、荧光素标记分离法两种。
（５）杂种细胞的鉴定
一般对于筛选出来的杂种细胞必须从形态学、细胞学、遗传学、生化分子生物学等方
面进行鉴定，从而确定其是否是真正的杂种细胞，一般从以下几个方面进行鉴定。
①形态学鉴定：植物的形态学特征可作为鉴别杂种的依据，体细胞杂种植株应具有两个 亲本的形态学特征，或与两亲本有区别，表现在叶形、花色素和植株形态等。
②细胞学鉴定：主要是对染色体数目及形态进行鉴定。
③同工酶分析：杂种细胞的同工酶谱应具有与双亲不同的特征，或表现为双亲酶带的总 和，或丢失部分亲本带和出现新的杂种带。
④生化测定：即根据植株中存在的特征酶进行鉴定。
⑤分子生物学方法：利用特异性限制性内切酶对叶绿体和线粒体基因组作酶切和电泳分 析，可以鉴定杂种细胞质中是否含有两个亲本细胞器的DN A重组。
２ ．动物细胞融合
采用动物体细胞融合技术，如今已实现了小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘的体 细胞杂交。
（１）动物细胞融合的基本过程
①细胞准备：对于贴壁培养的细胞可以直接将两亲本细胞混合培养，而悬浮细胞则需制 成一定浓度的悬液。
②诱导融合：虽然体细胞在体外培养过程中会自发融合，但效率低，因而需要添加促融 剂诱导融合。
③杂种细胞的选择：主要是利用选择性培养基，使亲本细胞死亡而让杂种细胞存活。 ④杂种细胞克隆：对选择出来的杂种细胞进行选择与纯化，再经过培养获得所需的无性 繁殖系。
（２）常用的促融剂
使细胞膜蛋白重新分布以及膜中脂质分子重排是诱导细胞融合的关键，常用的促融剂有 病毒、聚乙二醇（PEG） 、电场脉冲。
（３）杂种细胞的筛选 促融剂诱导后，并非所有的细胞都能融合。例如PEG诱导融合时，大约只有十万分之 一的细胞最终能够形成会增殖的杂种细胞。此外，细胞融合本身具有一定随机性，除不同亲 本细胞间的融合外，还伴有各亲本细胞的自身融合。因此，在细胞融合之后还必须通过一定 的实验方法把含有亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出来。
①筛选原理：筛选的目的是为了获得遗传性状比亲本细胞更加优良的杂种细胞。两种亲 本细胞融合后会形成五种类型的细胞，即异型融合细胞（双核和多核） 、两种同型融合细胞 （双核和多核）以及未发生融合的两种亲本细胞。筛选的一般原理就是在培养过程中利用选 择性培养基，杀死后面的四种类型细胞。为此，要根据筛选系统选择合适的亲本细胞或根据 细胞的生化生理特性选择合适的筛选系统。
②选择系统：常用的选择系统有H A T选择系统、抗药性选择系统和营养缺陷型选择系
统。
H A T选择系统是一种含有一定数量次黄 嘌呤（H） 、氨基蝶呤（A）及胸腺嘧啶核 苷
（T）的选择性培养基。
抗药性选择系统是利用生物细胞对药物敏感性的差异筛选杂种细胞的方法。
营养缺陷型筛选是如果某些细胞在一些营养物（如氨基酸、糖、嘌呤、嘧啶或者维生素
等）的合成能力上出现缺陷，而难以在缺少这种营养成分的培养基中存活，这类变异细胞便 称为营养缺陷型细胞。将两种不同营养缺陷型的细胞作为亲本进行融合，所形成的原养型融 合细胞可以在缺少这两种营养组分的培养基上生长，而两亲本细胞则不能生长，利用这一原 理进行的筛选便称为营养缺陷型筛选。
（４）杂种细胞的表型
与亲本细胞相比，细胞融合后所形成的杂种细胞在遗传表型上会发生一定的变化，表现 为互补作用、激活作用、消失作用、激活和消失作用。
①互补作用：是指两种亲本细胞的某些生物学特性在杂种细胞中共同表达的现象，如免 疫淋巴细胞可分泌抗体，但在体外培养不能生长；而小鼠骨髓瘤细胞可在体外生长，但它不 产生抗体。将这两者作为亲本进行细胞融合，融合后的杂种细胞既可以体外生长又可以分泌 抗体。这种优势互补作用往往是人们进行细胞融合所追求的实验目的。
②激活 作 用：是 指 某 一 亲 本 细 胞 的 不 活 动 基 因 在 杂 种 细 胞 中 被 激 活 的 现 象，如 用
H PR T及H PR T人的细胞分别与H PR T的小鼠细胞杂交，得到的两种杂交细胞均显示 出正常小鼠的H PR T活性。由此可见，人的细胞具有激活小鼠细胞H PR T基因的作用。
③消失作用：是指亲本的某一或某些性状在杂种细胞中消失的现象，如金黄色仓鼠黑色 素细胞具有很高的多巴氧化活性，可催化酪氨酸形成黑色素，但黑色素瘤细胞与不产生黑色 素的小鼠成纤维细胞融合的杂种细胞则不产生黑色素，表明多巴氧化酶基因在杂种细胞中被 抑制而呈隐性。另外，分泌单克隆抗体的淋巴细胞杂交瘤细胞在传代培养中有可能失去分泌 抗体的能力，这是由于淋巴细胞染色体丢失的结果，这也是消失现象的一种形式。
④激活和消失作用：是指细胞融合后杂种细胞中出现的同一亲本细胞的某一些非活动基 因被激活，而另一些遗传现象同时消失的现象。
四、遗传物质转移
第三节 植物细胞工程
一、微繁殖技术
植物的微繁殖技术（又称快速繁殖技术），其特点是繁殖速度快，周期短，不受季节气候、自然灾害等因素的影响。
植物的去病毒技术（又称脱毒技术），是微繁殖的一个分枝。植物的病毒病严重地影响着农业生产。
前景：
又称人造种子
第一，它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的影响。
第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，这是微繁殖难以达到的。
第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。 第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。 。
人工种子是由
体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成。
三大难题有待克服： ①许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚； ②
现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀； ③人工种子的贮藏有待 进一步完善。
三、单倍体诱导及其应用
四、原生质体培养与细胞融合
植物细胞与动物细胞最大的区别，在于它的外周有一层坚硬的细胞壁。细胞壁的主要成 分是纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等，去掉细胞壁的植物细胞称为原生质体。 终于在１９８５ ～ １９８９年先后由日本、法国、中国、
英国在水稻上首先突破。随后，小麦、玉米、小米、高粱、甘蔗、棉花、大豆等重要禾谷类 和豆类植物原生质体培养也先后获得成功，其中
等是由我国首次成功的
玉米、小麦、大豆、高粱、谷子
。此外，在药用植物、木本植物和蔬菜等方面，也取得较快的进展。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础 上建立起来的。植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱 导融合。由于植物细胞的全能性，因而融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂 种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括
三个主要环节：诱导融
合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。
１ ．诱导融合
化学法又分为离子诱导融合
法、高钙－高p H法、PEG（聚乙二醇）法。
诱导原生质体融合的方法有化学诱导和物理诱导两种。
２ ．选择融合体细胞
３ ．杂种植株的再生和鉴定 五、体细胞遗传变异及其利用
植物细胞的诱变因素与微生物细胞的基本相同，这也反映了整个生物界中遗传物质在本 质上是相同的。诱变剂可分物理和化学的两大类型。物理因素主要有X射线、 γ射线、高能 粒子、紫外线等。其中紫外线诱变不需要昂贵的设备，一般实验室都可以应用。化学诱变剂 都是一些结构复杂的试剂，一般都有毒性，大多有致癌作用，因而操作起来要特别小心
目前，已筛选到遗传变异植物主要有以下几类：营养缺陷型、抗氯酸盐、抗氨基酸、抗 抗菌素类药物、抗除草剂和抗病植物的新品种。
六、次生物质与植物细胞的大量培养
第四节 动物细胞工程
一、淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体
１９７５年有两位科学家，根据癌细胞可以在体外培养条件下无限传代增殖这一
特性，在PEG的作用下，将它与B淋巴细胞进行融合，结果得到了具有双亲遗传特性的杂 交细胞。它既能在体外迅速增殖，又能合成分泌特异性抗体，从而成功地解决了从一个淋巴 细胞制备大量单克隆抗体的技术难题。这项技术就是淋巴细胞杂交瘤技术。这两位科学家也 因此获得了１９８４年度诺贝尔奖。
二、胚胎干细胞
三、细胞融合四、细胞核移植
第五节 细胞工程的应用
细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的 配套技术。在
农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类作出巨大的贡献。
一、粮食与蔬菜生产
二、园林花卉
在果树、林木生产实践中应用细胞工程技术主要是
微繁殖和去病毒技术。几乎所有
的果
树都患有病毒病，而且多是通过营养体繁殖代代相传的。用去病毒试管苗技术，可以有效地 防止病毒病的侵害，恢复种性并加速繁殖速度。目前，香蕉、柑橘、山楂、葡萄、桃、梨、 荔枝、龙眼、核桃等十余种果树的试管苗去病毒技术，已基本成熟。
植物试管苗如松属、桉树属、杨属中的许 多种，还有泡桐、槐树、银杏、茶、棕榈、咖啡、椰
子树等
三、临床医学与药物 四、繁育优良品种
第四章 基因工程
基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
一、限制性内切酶
限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类型， 分别称为Ⅰ型、 Ⅱ型、 Ⅲ型。这三种不同的限制性内切酶具有不同的特征。 二、D N A连接酶。
1.T４D N A连接酶由一条多肽链组成，相对分子量为６８００Da，通常催化粘性末端间的连接效 率要比催化平末端连接效率为高。
2.体外D N A连接方法目前常用的三种：
（1）用T４或E性末端的D N A片段；
（2）用T４DN A连接酶连接具有平末端D N A片段；
（3）先在D N A片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再进行连接。
三、反转录酶。 四、基因载体
作为载体的物质必须具备以下条件：
能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记 基因，便于进行筛选。基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括质粒载体、 λ噬菌体载体、柯斯质粒载体、M１３噬菌体载体、真核细胞的克隆载体、人工染色体等。 １ ．质粒载体
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，经人工修饰改造后作为载体。它具有十分有利的 特性： ①具有独立复制起点；
②具有较小的相对分子质量，一般不超过１５kb； ③具有较高拷贝数，使外源D N A得以大量扩增； ④易于导入细胞；
⑤具有便于选择的标记和具有安全性。 柯斯质粒载体的优点：
① 具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体，仅以质粒形式存在；
② 具有质粒D N A的复制方式，重组D N A注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状D N A分子，如
同质粒一样进行复制。
③ 具有克隆大片段外源D N A的能力，柯斯质粒本身一般只有５ ～ ７kb左右，而它可克隆外源DN A
片段的极度限值竟高达４５kb，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力，这是其最大优
６ ．真核生物的载体
真核生物载体，主要有以下几大类： （１）酵母质粒载体
克隆和表达外源基因；DNA测序 构建基因文库和cDNA文库 构建基因文库
制备单链DNA；定位诱变；噬菌体展示
酵母质粒载体都是利用酵母的２μm质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR３２２构建而成 的，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，所以又称为穿梭载体。其主要有以下三种：
①附加体质粒（epislmal plasmid） ：该质粒载体含有来自细菌质粒pBR３２２的复制起点 并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（A mp ） 。此外，还有来自酵母２μm 质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的U R A３基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因３） ， 这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主 复制，且具有较高的拷贝数。
②复制质粒（replicating plasmid） ：该质粒含有来自细菌质粒pBR３２２的复制起点和 作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（A mp ）和四环素抗性基因（T et ） 。来自酵 母染色体的自主复制序列（A RS）以及作为酵母重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数 的质粒。
③整合质粒（integrating plasmid） ：该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR３２２的复制起点 和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（A mp ）和四环素抗性基因（T et ）以及